不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激中性粒细胞产生基质金属蛋白酶8和9的比较

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激中性粒细胞产生基质金属蛋白酶8和9的比较作者：欧阳玉玲 吴亚菲 赵蕾 肖晓蓉 张静仪 李小玉    作者单位：1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学；2.四川大学华西口腔医院 牙周科，四川 成都 610041     【摘要】  目的 比较不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）刺激下人外周血中性粒细胞（PMNs）产生基质金属蛋白酶8、9（MMP-8、MMP-9）的差异。方法 采用密度梯度离心分离法分离纯化培养PMNs，P.gingivalis ATCC33277（ⅠfimA）、WCSP 115（ⅡfimA）、WCSP 1.5（ⅢfimA）、W83（ⅣfimA）、WCSP 559（ⅣfimA）菌悬液与新鲜分离的PMNs悬液共孵育2 h，于5 min、30 min、1 h、2 h收集上清液，用ELISA方法检测MMP-8、MMP-9的表达。结果 不同fimA基因型P.gingivalis刺激PMNs产生MMP-8、MMP-9的能力都显著高于未受刺激组；ⅡfimA、ⅣfimA（W83）型P.gingivalis刺激PMNs分泌MMP-8在速度及量上均高于ⅢfimA、ⅣfimA（WCSP 559）型P.gingivalis；ⅠfimA、ⅡfimA、ⅣfimA（W83）型P.gingivalis刺激PMNs分泌MMP-9能力高于ⅢfimA、ⅣfimA（WCSP 559）型P.gingivalis。结论 ⅡfimA、ⅣfimA型P.gingivalis的致病能力相对较强，提示P.gingivalis的毒力和致病性与fimA基因型存在相关性。    【关键词】  牙龈卟啉单胞菌 中性粒细胞 基质金属蛋白酶　　Matrix metalloproteinase 8 and 9 regulations of polymorphonuclear leukocytes stimulated by Porphyromonas gingivalis with different fimA genotypes  OUYANG Yu-ling1, WU Ya-fei2, ZHAO Lei1, XIAO Xiao-rong1, ZHANG Jing-yi1, LI Xiao-yu1.（1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Periodontics, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）　　 [Abstract]  Objective  To investigate the pathogenicity of matrix metalloproteinase 8, 9（MMP-8, MMP-9） regula-tions of polymorphonuclear leukocytes（PMNs） by challenge of Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis） with different fimA genotypes. Methods  The studies mainly adopt the isopycnic sedimentation separation to separate the PMNs from human peripheral blood. P.gingivalis ATCC 33277（typeⅠ），WCSP 115（typeⅡ），WCSP 1.5（typeⅢ），W83（typeⅣ），WCSP 559（typeⅣ） were assessed for their inductions of MMP-8, MMP-9 expression in PMNs. MMP-8, MMP-9 protein levels in culture supernatant were determined by ELISA at different time intervals（5 min, 30 min, 1 h, 2 h）following continuous co-culture of bacteria with PMNs. Results  MMP-8 and MMP-9 protein levels produced by PMNs co-culture with the ⅠfimA—ⅣfimA P.gingivalis were significantly stronger than unsimulated group. The velocity and quantity of MMP-8 produced by PMNs co-culture with the ⅡfimA P.gingivalis and ⅣfimA P.gingivalis were more than ⅢfimA, ⅣfimA P.gingivalis. The MMP-9 protein levels produced by PMNs co-culture with the ⅠfimA, ⅡfimA, ⅣfimA P.gingivalis was significantly stronger than ⅢfimA and ⅣfimA P.gingivalis. Conclusion  ⅡfimA and ⅣfimA P.gingivalis have stronger pathogenicity relatively, which indicate that fimA genotype is associated with pathogenesis of P.gingivalis.　　[Key words]  Porphyromonas gingivalis； polymorphonuclear leukocyte； matrix metalloproteinase　　牙周炎是一种慢性感染性疾病，牙周炎症过程中，炎细胞及多种牙周组织细胞所表达的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）参与了牙周结缔组织的破坏及牙槽骨的吸收[1]，MMP-8是间质型胶原酶，MMP-9是Ⅳ型胶原酶，又叫明胶酶，主要由中性粒细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMNs）分泌，能分解Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原、明胶及弹性蛋白等，在牙周组织的破坏过程中起重要作用。　　牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周炎的主要致病菌[2]，菌毛是其主要的毒力因子，根据菌毛素编码基因fimA基因开放阅读框架核苷酸序列的差异，可将P.gingivalis分为6型（Ⅰ~Ⅴ和Ⅰb型）[3-6]。近年来国内外学者从动物炎症反应、对牙周组织细胞的侵入和致炎能力等方面进行了研究，发现不同fimA基因型P.gingivalis之间致病力存在差异[7-9]，但是有关不同fimA基因型P.gingi-valis刺激炎症反应细胞（如PMNs、单核细胞等）的差异尚缺乏相关研究。本研究拟采用ELISA法从蛋白水平比较不同fimA基因型P.gingivalis刺激下PMNs分泌MMP-8、MMP-9的水平，进一步探讨不同fimA基因型P.gingivalis致病力的差异。1  材料和方法　　1.1  主要材料和仪器　　P.gingivalis标准菌株（ATCC 33277，W83，四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供），P.gingi-valis临床菌株由本课题组前期实验获得，分别为Ⅱ（WCSP 115）、Ⅲ（WCSP 1.5）、Ⅳ（WCSP 559） fimA型P.gingivalis；MMP-8、MMP-9 ELISA试剂盒（R&D公司，美国）。厌氧培养箱（DY-Ⅱ型，浙江义乌冷动机总厂），Crystal Spec 比浊仪（Becton Dickinson公司，美国），MCO－15AC二氧化碳恒温孵箱（Sanyo公司，日本），IX70倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），人粒细胞和白细胞分离液LTS11131（天津灏洋生物制品科技有限公司），HTS 7000plus多孔板（紫外/荧光/可见光）高效分析仪（PE公司，美国）。　　1.2  方法　　1.2.1  不同fimA基因型P.gingivalis与PMNs反应分组　　对照组：未受刺激的PMNs。实验组：分为5组。T1组：ⅠfimA型菌株ATCC 33277刺激的PMNs；T2组：Ⅱ fimA型菌株WCSP 115刺激的PMNs；T3组：Ⅲ fimA型菌株WCSP 1.5刺激的PMNs；T4组：Ⅳ fimA型菌株W83刺激的PMNs；T5组：Ⅳ fimA型菌株WCSP 559刺激的PMNs。　　1.2.2  PMNs的分离鉴定  取数名无吸烟史、牙周及全身健康志愿者的全血，加入肝素钠抗凝管，采用梯度密度离心法[10]分离PMNs。先加1/3体积的6%右旋糖酐生理盐水于新鲜血液中，混匀后离心使红细胞下沉。取上层按1∶1比例缓慢叠加到聚蔗糖-泛影葡胺分层液面上，500 r/min离心30 min。离心后弃上层液，将沉淀细胞用0.83%NH4Cl溶液破除红细胞，直至无红细胞为止。洗涤细胞后，将细胞悬于DMEM细胞培养液中，Giemsa染色涂片后发现细胞核为杆状核、二叶、三叶、四叶核，即证实分离所得PMNs的纯度大于95%；应用台盼蓝拒染实验检测，证实其活细胞率大于等于95%，细胞计数并调整其密度为每毫升1×106个。　　1.2.3  不同fimA基因型P.gingivalis菌悬液的配制  分别将脱脂牛奶中冻存的P.gingivalis ATCC 33277、WCSP 115、WCSP 1.5、W83、WCSP 559在BHI血平板（含5%冻融兔血、1%血晶素和维生素K）上常规厌氧培养法复苏后，转移到BHI液体培养基中增菌48 h，并鉴定其为纯培养，取对数生长期的菌株悬浮于新鲜配置的PBS中制成5种菌悬液，采用细菌比浊仪分别将5种菌悬液密度调整至1×108 CFU/mL，6 000 r/min，15 min离心取沉淀，再用不含小牛血清的低糖DMEM培养液重新悬浮备用。　　1.2.4  不同fimA基因型P.gingivalis与PMNs反应  新鲜分离配制好的PMNs细胞悬液（每毫升1×106个）接种1 mL到24孔板中，复种2孔，将配制好的5种P.gingivalis菌悬液（1×108 CFU/mL）及阴性对照组无菌DMEM培养液1 mL等体积加入到24孔板中，使细菌攻击细胞的比率为100∶1, 细菌细胞均匀混合于37 ℃孵箱中孵育5 min、30 min、1 h、2 h，收集各时间点标本，然后于低温4 ℃离心机6 000 r/min离心10 min，收集细胞上清液，无菌离心管收集，-80 ℃冻存，用于MMP-8、MMP-9水平的检测。　　1.2.5  ELISA法检测上清液中MMP-8和MMP-9的水平  采用MMP-8、MMP-9 ELISA试剂盒，根据使用说明书，绘制标准曲线，每孔加入样本100 μL后，采用HTS 7000plus多孔板高效分析仪在485 nm双波长下测定各孔样本光密度值，并自动换算出样本中MMP-8、MMP-9质量浓度（ng/mL）。　　1.2.6  质量控制  将实验步骤1.2.4重复3次，所有操作由同一人完成以减少实验误差。　　1.2.7  统计学分析  采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析（ANOVA）和LSD法多重比较进行统计学处理，检验水准为双侧α=0.05。2  结果　　2.1  不同fimA基因型P.gingivalis对PMNs分泌MMP-8水平的影响表1结果经ANOVA分析和LSD法多重比较发现：1）在4个时间点中，除了1 h的T1组，所有P.gingivalis刺激PMNs时，PMNs分泌MMP-8的水平都高于对照组（P＜0.05）。表明不同fimA基因型P.gingivalis刺激下，PMNs表达MMP-8的量均增加。2）T2组在5 min时，产生的MMP-8的水平高于T3组和T5组；2 h时，T2组产生的MMP-8量达到最高，且高于其余各组（P＜0.05）。3）T3组在30 min时MMP-8的量低于其他各组（P＜0.05）。4）T4组在5 min时产生的MMP-8量高于T3组和T5组，差异有统计学意义（P＜0.05）。5）T1组在1 h时低于所有实验组，在2 h低于T2组, 其他时间段与其他实验组没有统计学差异。　　2.2  不同fimA基因型P.gingivalis对PMNs分泌MMP-9水平的影响表2经ANOVA分析和LSD法多重比较发现：1）在4个时间点中，不同fimA基因型P.gingivalis对PMNs分泌产生的MMP-9的水平都高于对照组（P＜0.05）。表明不同fimA基因型P.gingivalis刺激下，PMNs表达MMP-9的量均增加。2）T1组在5 min、1 h、2 h时产生的MMP-9高于T3组和T5组（P＜0.05），但是与T2﹑T4组比较尚不具有统计学差异。3）T2组在2 h时产生的MMP-9高于T3组、T5组（P＜0.05）。4）T4组在5 min、1 h、2 h时产生的MMP-9高于T3组，2 h时还高于T5组（P＜0.05）。3  讨论　　P.gingivalis是目前公认的牙周主要致病菌之一，它产生多种毒力因子影响牙周炎的发生发展。PMNs是机体抗牙周致病菌的第一道防线，同时PMNs也是一把双刃剑，受到细菌刺激的PMNs会释放多种溶酶体酶，如MMP-8和MMP-9等参与牙周组织的破坏。本研究发现，在没有受到P.gingivalis刺激时，PMNs在2 h内会低水平释放MMP-8、MMP-9；当受到不同fimA基因型P.gingivalis刺激时，其释放MMP-8、MMP-9的量都显著高于无P.gingivalis刺激时，说明在P.gingivalis的作用下，PMNs能够脱颗粒并释放大量组织破坏性酶造成牙周组织破坏。此结果与Ding等[11]的研究结果接近，再次证明P.gingivalis刺激PMNs产生破坏性酶是其重要毒力特性之一，也说明P.gingivalis能通过刺激PMNs而加剧牙周组织破坏。　　现有国内外研究显示，ⅡfimA型和ⅣfimA型P.gingivalis在牙周炎患者的龈下菌斑中检出率高，被认为与牙周炎关系密切；而ⅠfimA型P.gingivalis则在健康人中检出率高，与牙周炎的相关性较弱[5-6，12-13]。Nakano等[14]进行的体外动物实验研究显示，Ⅱ和ⅣfimA型P.gingivalis引发鼠的炎症反应要强，而Ⅰ、ⅢfimA型P.gingivalis则较弱。Sugano等[8]的体外细胞毒性实验也证明，ⅡfimA型P.gingivalis刺激巨噬细胞产生白细胞介素-1β、白细胞介素-8、白细胞介素-12、肿瘤坏死因子-α的水平高于ⅠfimA型P.gingivalis，上述研究结果推测：Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis的致病力强于Ⅰ、ⅢfimA型P.gingivalis。　　Ding等[11]研究显示，不同细菌及同一种细菌的不同菌株之间与PMNs作用时产生破坏性酶的量有差异，提示这种差异与细菌及菌株间毒力的差异相关。本研究通过对各fimA型P.gingivalis刺激PMN释放MMP-8、MMP-9水平的比较，发现ⅡfimA型、ⅣfimA型P.gingivalis刺激PMNs产生MMP-8、MMP-9的能力强于Ⅲ fimA型P.gingivalis。MMP-8和MMP-9能分解在牙周组织中含量最多的Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原及明胶、弹性蛋白酶等，MMP-8、MMP-9生成增多必然会对牙周组织造成直接的破坏，提示Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis的致病能力较强。　　本研究发现，ⅠfimA型P.gingivalis刺激PMNs分泌MMP-9能力高于ⅢfimA、ⅣfimA（WCSP559）型P.gingivalis，与ⅡfimA、ⅣfimA（W83）型P.gingivalis无明显差异。造成这种结果的原因不详，可能ⅠfimA型P.gingivalis具有较强的弹性蛋白酶样活性及侵入宿主细胞的能力[15]，在刺激PMNs释放MMPs的毒力性能方面可能与Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis相似；当然也有可能存在标准株细菌和临床株细菌之间毒力的差别；进一步研究可对ⅠfimA型临床株和标准株P.gingivalis进行比较，并可试图研究不同fimA型P.gingivalis菌体微观毒力结构方面的区别，以探究其毒力差异的原因。　　本实验探讨不同fimA基因型P.gingivalis与PMNs的作用，从一个方面反映了不同fimA基因型P.gingivalis致病力差异，进一步证明了Ⅱ、ⅣfimA型P.gingivalis致病能力较强的结论，为寻找与牙周炎发生发展关系密切、高毒力的P.gingivalis菌株[16]提供了新的证据，同时也发现临床细菌株与标准细菌株之间可能存在的毒力差异。【参考文献】  [1] 曹采方． 牙周病学[M]． 北京： 人民卫生出版社, 2000：127．CAO Cai-fang. Periodontology[M]. Beijing： People′s Medical Pub-lishing House, 2000：127．  [2] Petsios A, Nakou M, Manti F, et al. Microflora in adult peri-odontitis[J]. J Periodontal Res, 1995, 30（5）：325-331.  [3] Fujiwara T, Nakagawa I, Morishima S, et al. Inconsistency be-tween the fimbrilin gene and the antigenicity of lipopolysaccha-rides in selected strains of Porphyromonas gingivalis[J]. FEMSMicrobiol Lett, 1994, 124（3）：333-341.   [4] Nakagawa I, Amano A, Kimura RK, et al. Distribution andmolecular characterization of Porphyromonas gingivalis carrying anew type of fimA gene[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38（5）：1909-1914.  [5] Nakagawa I, Amano A, Ohara-Nemoto Y, et al. Identification ofa new variant of fimA gene of Porphyromonas gingivalis and itsdistribution in adults and disabled populations with periodontitis[J]. J Periodontal Res, 2002, 37（6）：425-432.  [6] Amano A, Nakagawa I, Kataoka K, et al. Distribution of Porphy-romonas gingivalis strains with fimA genotypes in periodontitispatients[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37（5）：1426-1430.  [7] Nakagawa I, Amano A, Kuboniwa M, et al. Functional differ-ences among FimA variants of Porphyromonas gingivalis andtheir effects on adhesion to an invasion of human epithelial cells[J]. Infect Immun, 2002, 70（1）：277-285.  [8] Sugano N, Ikeda K, Oshikawa M, et al. Differential cytokineinduction by two types of Porphyromonas gingivalis[J]. Oral Micro-biol Immunol, 2004, 19（2）：121-123.  [9] Elisoa A, Daniel G, Mahmoud R, et al. In vitro models of tissuepenetration and destruction by Porphyromonas gingivalis[J]. InfectImmun, 2004, 72（8）：4689-4698.  [10] 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[M]. 西安： 世界图书出版社,1996：294-298.SITU Zhen-qiang, WU Jun-zheng. Cell culture[M]. Xi′an： WorldPublishing House, 1996：294-298.  [11] Ding Y, Haapasalo M, Kerosuo E, et al. Release and activationof human neutrophil matrix metallo-and serine proteinases duringphagocytosis of Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalisand Treponema denticola[J]. J Clin Periodontol, 1997, 24（4）：237-248.  [12] 郭永华, 吴亚菲, 刘天佳, 等. 不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌 在慢性牙周炎患者中的分布[J]. 华西口腔医学杂志, 2005, 23（2）：99-102.GUO Yong-hua, WU Ya-fei, LIU Tian-jia, et al. The distributionof fimA genotype of Porphyromonas gingivalis in chronic perio-dontitis patients[J]. West China J Stomatol, 2005, 23（2）：99-102.  [13] 赵蕾, 吴亚菲, 杨禾, 等. 成人牙周健康状况与fimA基因型牙龈卟啉单胞菌的相关性[J]. 华西口腔医学杂志, 2007, 25（3）：237-241.ZHAO Lei, WU Ya-fei, YANG He, et al. Prevalence of fimAgenotypes of Porphyromonas gingivalis and periodontal healthstatus[J]. West China J Stomatol, 2007, 25（3）：237-241.  [14] Nakano K, Kuboniwa M, Nakagawa I, et al. Comparison of in-flammatory changes caused by Porphyromonas gingivalis withdistinct fimA genotypes in a mouse abscess model[J]. Oral Micro-biol Immunol, 2004, 19（3）：205-209.  [15] Umeda JE, Missailidis C, Longo PL, et al. Adhension andinvasion to epithelial cells by fimA genotypes of Porphyromonasgingivalis[J]. Oral Microbiol Immunol, 2006, 21（6）：415-419.  [16] Frandsen EV, Poulsen K, Curtis MA, et al. Evidence of re-combination in Porphyromonas gingivalis and random distributionof putative virulence markers[J]. Infect Immun, 2001, 69（7）：4479-4485.