不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布

不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布作者：汪贯华,张冬梅,潘亚萍    作者单位：中国医科大学附属口腔医院 牙周科，辽宁 沈阳 110002    【摘要】 　目的 分析不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布状况。方法 收集50例慢性牙周炎患者的150个龈下菌斑样本，采用16S rDNA 聚合酶链反应（PCR）法检测牙龈卟啉单胞菌在牙周炎病变位点的检出率，并根据各rag基因型的特异性引物检测牙龈卟啉单胞菌不同rag基因型在慢性牙周炎病变位点的分布。结果 经16S rDNA PCR法检测，病变位点牙龈卟啉单胞菌阳性检出率为70.7%。各rag基因型在牙龈卟啉单胞菌阳性位点的总检出率：rag-1为60.4%，rag-2为23.6%，rag-3为44.3%，rag-4为15.1%；经统计学检验，rag-1和rag-3型检出率较高，高于rag-2和rag-4型（P<0.05）。结论 慢性牙周炎患者龈下菌斑中的牙龈卟啉单胞菌存在rag基因多态性，rag-1和rag-3基因型牙龈卟啉单胞菌与中国辽宁地区人群慢性牙周炎的发生发展关系密切。    【关键词】  牙龈卟啉单胞菌,基因型,rag基因　　Distribution of rag genotypes of Porphyromonas gingivalis in patients with chronic periodontitis  WANG Guan-hua, ZHANG Dong-mei, PAN Ya-ping. （Dept. of Periodontics, School of Stomatology, China Medical University, Shenyang 110002, China） 　 [Abstract]  Objective  To investigate the distribution of rag genotypes of Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis） in chronic periodontitis patients. Methods  Subgingival plaque samples were collected from 50 chronic periodontitis patients. The occurrence of P.gingivalis was determined by polymerase chain reaction（PCR） using 16S rDNA-spe-cific primers. Distribution of rag genotypes was assessed in P.gingivalis positive samples by PCR. Results  The occurrence of P.gingivalis was 70.7%, and the distribution of four rag genotypes among P.gingivalis positive samples was as follows: rag-1 60.4%; rag-2 23.6%; rag-3 44.3%; rag-4 15.1%, respectively. Conclusion  P.gingivalis with various rag genotypes was present in subgingival plaque samples from chronic periodontitis patients, and P.gingivalis with rag-1 and rag-3 were more predominant in chronic periodontitis patients, which may be associated with the development of periodontitis.　　[Key words]  Porphyromonas gingivalis； genotype； rag gene　　牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是目前公认的慢性牙周炎的主要致病菌之一[1]，能分泌大量的毒力因子，导致牙周组织破坏[2]。以往，人们认为细菌的致病性是单因素的，或者说是细菌的某一个或几个致病因子发挥决定性作用。致病岛（pathogenicity islands，PAI）的发现使人们对细菌致病性有了进一步的认识[3]。目前，rag位点被确定是P.gingivalis的致病岛基因之一[4]，该位点主要含有基因ragA和ragB，分别编码RagA和RagB蛋白。RagA是TonB类受体外膜蛋白；而RagB是一种表面抗原，Rag蛋白构成膜转运系统，协助细菌从外部环境获取转运大分子，有助于细菌的存活和散播；同时Rag蛋白还能够激活宿主的免疫及炎症反应。研究证实，rag位点的失活会降低P.gingivalis的致病性，减少对牙周组织的破坏[5-6]。rag位点在临床菌株中有4种不同的基因型[7-8]，分别命名为rag-1、　　rag-2、rag-3和rag-4，不同基因型的致病能力也不同。Hall等[7]发现，不同rag基因型的分布有一定的种族和地域差异。本研究采用聚合酶链反应（polymerasechain reaction，PCR）方法检测不同rag基因型P.gingivalis在慢性牙周炎患者中的分布特点，探讨rag基因型与慢性牙周炎的相关关系。1  材料和方法　　1.1  病例选择及牙周临床指标检查　　选择中国医科大学附属口腔医院牙周科就诊的慢性牙周炎初诊患者50例为研究对象，其中男27例，女23例，年龄24～73岁，平均年龄43.4岁，均为辽宁地区常住居民。慢性牙周炎的诊断标准采用Armitage（1999年）新分类法[9]，要求患者无全身系统性疾病，妇女无妊娠，至少1年未接受牙周系统治疗，近3个月内未服用抗菌药物，且知情同意。检查患者的牙周状况，记录牙周探诊深度（probing depth，PD）和临床附着丧失（clinical attachmentloss，CAL）。每例患者选取3个慢性牙周炎病变位点为取样位点，要求该位点PD＞3 mm且CAL≥1 mm；拍摄取样牙齿的X线片，记录牙槽骨吸收程度。　　1.2  样本的采集及分组    受试者清水漱口，采样患牙经龈上洁治后，无菌棉球隔湿，龈下刮治器取龈下菌斑，置于装有1 mL PBS缓冲液的无菌离心管中。所有检查及操作均由同一检查者完成，共采集菌斑样本150个。根据取样位点的牙周病变程度[10]，将150个菌斑样本分为2组：轻度慢性牙周炎组（简称轻度组）和中重度慢性牙周炎组（简称中重度组）。轻度组72个样本，取样位点3 mm＜PD≤4 mm、1 mm≤CAL≤2 mm、牙槽骨吸收不超过根长1/3；中重度组78个样本，取样位点PD＞4 mm、CAL＞2 mm、牙槽骨吸收超过根长1/3。　　1.3  模板DNA的提取 　　采用常规酚-氯仿法提取龈下菌斑DNA。用紫外分光光度计测量所提取DNA在260 nm和280 nm处的吸光度值，计算二者比值。比值为1.7～2.0表示DNA纯度良好。　　1.4  P.gingivalis和4种rag基因型的PCR检测　　P.gingivalis 16S rDNA和4种rag基因型特异性引物序列见表1，引物均由TaKaRa沈阳联星生物技术有限公司合成。PCR反应体系：10×反应缓冲液2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.15 μL，菌斑DNA 2.0 μL，用无菌双蒸水补足总体积至25 μL。PCR循环条件：94 ℃预变性5 min，变性94 ℃ 45 s，退火（16S rDNA为58 ℃，rag为50 ℃）45 s，延伸72 ℃ 1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。反应结束后用质量分数1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用100 bp Ladder DNA Marker确定产物的相对分子质量。P.gingivalis标准株W83作为阳性对照（中国医科大学口腔医学院中心实验室提供），等体积双蒸水作为空白对照。　　PCR质控：所有实验样本的测定均在盲法下进行，并随机抽取10%的样本做重复性实验。　 1.5  统计分析　　用SPSS 12.0统计软件进行?掊２检验，比较4种rag基因型检出率的差异。检验水准为双侧α＝0.05。2  结果　　2.1  PCR产物的电泳结果　　2.2  P.gingivalis的PCR检测结果　　50例慢性牙周炎患者检出P.gingivalis阳性者43例，占86.0％。150个龈下菌斑样本中，106个菌斑样本P.gingivalis阳性，病变位点总检出率为70.7％；轻度组72个菌斑样本和中重度组78个菌斑样本中，P.gingivalis阳性的样本分别为48和58个，检出率分别为66.7％和74.4％。经统计学检验，轻度组和中重度组P.gingivalis阳性检出率无统计学差异（P＞0.05）。　　2.3  不同rag基因型P.gingivalis菌株的分布　　4种rag基因型P.gingivalis菌株的分布情况见表2。从总检出率来看，rag-1型的检出率最高，rag-3型次之，均高于rag-2型和rag-4型，且均有统计学意义。rag-1型在中重度组的检出率高于轻度组，rag-4型在轻度组的检出率高于中重度组，其差异有统计学意义。另外，检测出不属于任何一型的样本1例。　　2.4  rag基因型与中重度慢性牙周炎的联系强度　　4种rag基因型与中重度慢性牙周炎的OR值和可信区间见表3。由表3可见，rag-1型和rag-4型与中重度慢性牙周炎的联系强度有统计学意义；rag-1型基因与中重度慢性牙周炎的联系强度较高，为3.10。3  讨论　　 rag位点已被确定为P.gingivalis的致病岛基因之一，该位点在临床菌株中有4种不同的基因型，提示不同P.gingivalis菌株的rag基因存在广泛的异质性，而遗传异质性的变化又是细菌致病性差异的基础。本研究结果表明，rag-1型的检出率最高，rag-3型次之，rag-4型的检出率最低；提示rag-1型和rag-3型P.gingivalis与中国辽宁地区人群慢性牙周炎的发生发展密切相关。4种rag基因型的基因及氨基酸序列有较大差异，这可能与基因转移及重组的过程中发生的大片段基因的获得和缺失从而产生基因突变有关。尽管如此，4种rag基因型所编码的RagA和RagB蛋白都分别与拟杆菌属的SusC和SusD蛋白具有同源性。不同的是，RagA1和RagA2蛋白中均存在CirA功能区，它是一种外膜受体蛋白，与无机离子的转运（主要是铁）和代谢有关，而在RagA3和RagA4蛋白中则未发现该功能区。由此推测，具有CirA功能区的RagA蛋白能够协助P.gingivalis从外界环境摄取铁，满足其生长繁殖和代谢的需要，从而使P.gingivalis在炎性环境下具有更强的生命力。此外rag-1型和rag-2型基因的上游均存在一个插入序列，分别为ISpg1和ISpg3，其编码的蛋白均为转座酶。研究发现[4，12]，该插入序列可能与细菌对抗生素的耐药功能和毒力相关的活性有关。因此推测，携带含有插入序列的rag基因的P.gingivalis可能具有更强的耐药性和致病性。然而，目前只发现rag-1型基因与慢性牙周炎有明显相关性，并没有试验证实rag-2型基因与慢性牙周炎的相关性。但是本研究发现在rag-1型基因下游存在一个以ORF3编码的假定蛋白，而在rag-2型基因中则不存在。许多基因的表达常常受其上下游基因片段的调控，rag-1型基因下游存在的ORF3是否是导致其不同于rag-2型基因的原因还有待于进一步研究证实。4种RagB蛋白均为免疫抗原，能够与宿主产生IgG免疫反应，但是它们彼此之间在结构及功能上的差异目前还没有被证实。综上所述，4种rag基因型不同的检出率可能与致病岛基因在进行基因转移及重组的过程中产生的基因突变有关。基因突变使P.gingivalis的rag位点含有不同的基因和氨基酸序列，使P.gingivalis的生存能力和致病性发生改变，携带rag基因检出率高的P.gingivalis能够适应新的环境，朝着更有利的生存方式发展，从而成为特定环境下的一类优势菌群[13]。　　在牙周病变程度不同的病变位点，4种rag基因型的分布有所不同，提示不同rag基因型P.gingivalis引起牙周组织病变的程度存在差异。本研究结果显示：携带rag-1型基因P.gingivalis的患者发生中重度慢性牙周炎的可能性是发生轻度慢性牙周炎的3.10倍（OR=3.10），而携带rag-4型基因P.gingivalis的患者发生中重度慢性牙周炎的可能性是发生轻度慢性牙周炎的0.15倍（OR=0.15）。该结果表明rag-1型P.　　gingivalis能够导致较重的牙周病变并能进一步加重牙周组织破坏，而rag-4型P.gingivalis引起的牙周病变相对较轻，引起牙周组织破坏的能力相对较弱。　　本试验以中国辽宁地区慢性牙周炎人群为研究对象，发现rag-1型和rag-3型P.gingivalis与慢性牙周炎的发生发展密切相关。这一结果为研究不同rag基因型P.gingivalis的种族和地域差异提供了试验基础，并为研究P.gingivalis的致病性差异提供了依据。【参考文献】[1] Haffajee AD, Socransky SS. 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