癌细胞与间质细胞共培养的形态学观察

癌细胞与间质细胞共培养的形态学观察作者：王东关,李新功,高虹,孙希印,周晓秋,孙善珍    作者单位：1.东营市人民医院 病理科，山东 东营 257034；2.山东大学口腔医院 病理科，山东 济南 250012    【摘要】  目的 研究在体外间质细胞对癌细胞生长的影响，为肿瘤治疗提供理论基础。方法 体外分离培养口腔癌间质细胞（TSF）和正常口腔组织间质细胞（NSF），并分别与口腔舌鳞癌Tca8113细胞系共培养，观察两者相互影响的方式。结果 癌细胞与NSF共培养时，癌细胞增生快，迅速形成集落，间质细胞增生慢，逐渐连接成片状和网状，癌细胞被分割包围，癌细胞单个或成片的收缩、变圆、悬浮，最终均为间质细胞排挤，位置被占据。癌细胞与TSF共培养，间质细胞增生慢，但伸出多个突起，增生活跃的癌细胞先是沿突起两侧增生，或伸出短小的突起与TSF的突起或胞体相连，增生的癌细胞逐渐覆盖TSF的突起，并最终完全覆盖TSF的胞体，最后覆盖的是细胞核所在的部位。随后TSF的结构溶解消失，留下多个癌细胞排列成TSF的形状。结论 NSF排斥癌细胞，不利于癌细胞生长或抑制癌细胞的生长；TSF可促进癌细胞的生长，是癌细胞生长的基础和前进的桥梁。    【关键词】  口腔,癌,间质细胞,共培养　　Morphologic observation of oral cancer cells cocultured with mesenchymal cells in vitro  WANG Dong-guan1, LI Xin-gong1, GAO Hong1, SUN Xi-yin1, ZHOU Xiao-qiu1, SUN Shan-zhen2. （1. Dept. of Pathology, Dongying People′s Hospital, Dongying 257034, China；2. Dept. of Pathology, School of Stomatology, Shandong University, Jinan 250012, China）　　[Abstract]  Objective  To study the morphologic and growing alterations of oral cancer cell line Tca8113 before and after cocultured with tumor stromal fibroblasts（TSF） and normal stromal fibroblasts（NSF） respectively, and evalu-ate the influence of mesenchymal cells on tumor cells. Methods  TSF and NSF were isolated and cultured. To ob-serve the morphologic change of Tca8113 cells after cocultured with TSF and NSF respectively. Results  When co-cultured with NSF, the Tca8113 cells proliferated as rapidly as monocultured to form colonies, while the NSF proliferated slowly to form pieces and then joined each other to form network. The NSF network segmented and surrounded the colonies of cancer cells so that the cancer cells shrank, turn round, broke away from the bottom and floated into the medium. The cancer cells proliferated actively but they were elbow out entirely in the end. TSF proliferated slowly when cocultured with cancer cells, projected several branched protrusions. The cancer cells proliferated along the two sides of protrusions of TSF, or projected short protrusions to connect the body or protrusions of TSF, and overlaid the protrusions gradually, finally, cover the body. In the end, TSF melt away, and the cancer cells took on the figure of TSF. Conclusion  The results do suggest that, oral cancer cell line Tca8113 are restrained when coculture with NSF, but are promoted when with TSF.　　[Key words]  oral； cancer； stromal fibroblasts； coculture　　现代肿瘤的放化疗、生物疗法、基因疗法等几乎都是针对肿瘤细胞本身，忽视了间质细胞在肿瘤细胞浸润、转移、治疗过程中的作用。直到20世纪80年代，口腔癌间质细胞（tumor stromal fibroblasts，TSF）被认为是肿瘤组织中被动的结构成分，是肿瘤侵蚀的底物[1-2]。此后，才逐步认识到成纤维细胞是肿瘤生长和扩散的主动参与者和调节者[3-5]。并且，TSF和它们的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）　　还可能参与肿瘤早期的发展。Olumi等[6]发现成纤维细胞可以指导肿瘤的演进。Nejjari等[7]发现TSF可促进纤维连接蛋白介导的肿瘤细胞的局部浸润。本研究拟通过体外共培养的方式研究正常口腔组织间质细胞（normal stromal fibroblasts，NSF）和TSF对癌细胞生长的影响。1  材料和方法　　1.1  材料　　口腔舌鳞癌Tca8113细胞系（中国科学院上海细胞库），DMEM（Gibco公司，美国），胎牛血清、小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），vi-mentin抗体（迈新试剂公司，克隆号V9，染色过程按说明书进行）。　　1.2  方法　　1.2.1  TSF与NSF的原代培养  在手术切下的口腔癌或喉癌组织中，选取肿瘤深部未坏死的生长旺盛的组织数块，置于含500 μg/mL青霉素和500 μg/mL链霉素的DMEM或D-Hanks中，带回细胞培养室。无菌PBS洗3次后，切取远离坏死和溃烂的肿瘤组织，切成1～4 mm3的小块，均匀放置于细胞培养瓶底，将培养瓶倒置，放于培养箱内，4～5 h后加入含有15％胎牛血清的DMEM培养液，使培养液刚刚没过组织块。每2 d换1次液，3～4 d开始有癌细胞和间质细胞从边缘长出。细胞长满瓶后，消化传代，3代以后癌细胞完全消失，只剩下梭形的间质细胞，即TSF，主要是成纤维细胞。传代细胞培养于含10%小牛血清和2 mmoL谷氨酰胺的DMEM中。NSF原代培养与上述方法相同，只是组织块要取自远离癌组织1 cm或良性肿瘤外的组织。　　1.2.2  Tca8113细胞与TSF、NSF共培养  将Tca8113细胞、TSF和NSF均调至每毫升1×105个，相同体积的两种细胞溶液（Tca8113细胞分别与TSF、NSF）混匀后加到放有盖玻片的培养皿内，溶液高度4 mm左右。根据需要培养2～4 d，每2 d换液1次。待细胞长到需要的密度后，取出盖玻片，用PBS冲洗3次，冷丙酮固定30 min，晾干备用。　　1.2.3  细胞形态观察  将Tca8113细胞、TSF、NSF的单独爬片和共培养爬片行HE、免疫组化染色，倒置显微镜观察其形态学变化。2  结果　　2.1  Tca8113细胞、TSF、NSF单独培养时的形态　　Tca8113细胞富于核分裂，核仁4～5个，细胞呈上皮样，胞体向周围伸出多个短而宽的突起，局部细胞出现角化珠和单细胞角化（图1）。　　NSF为长梭形，从一端或两端伸出1～2个细长的突起，突起的长度很少超过胞体的长度，少量细胞呈星形，伸出多个突起，核居中，细胞间差异小（图2）；在细胞生长融合成片时，细胞排列成火焰状等，突起可覆盖在其他胞体上，但胞体很少有相互覆盖，即细胞有接触抑制。　　TSF单细胞为胖梭形，细胞间大小和形状差异大，胞体宽大，从一端或两端伸出多个突起，有的突起像树枝样，有多极分支，突起的长度可超过胞体的长度，最长可达胞体3倍。少量细胞呈星形，伸出多个突起（图3）；核居中，在细胞生长密集时，细胞的胞体及突起交织成网状，出现火焰状等排列，突起可覆盖在其他胞体上，胞体也可相互覆盖，即细胞间接触抑制不明显。　　2.2  Tca8113细胞与TSF、NSF共培养时的形态观察　　Tca8113细胞与TSF或NSF共培养早期生长模式相似，等量的两种细胞随机混合贴壁，间质细胞贴壁的时间要快于癌细胞，但癌细胞分裂增殖的速度要快于间质细胞，迅速形成细胞集落，间质细胞增殖开始晚而慢。　　Tca8113细胞与NSF共培养，癌细胞增生快，迅速形成集落，间质细胞增生慢，NSF在癌细胞集落之间增生呈大小不等片状并连接成网，把癌细胞分割包围，NSF逐渐压缩癌细胞生长空间，癌细胞单个或成片的收缩、变圆、悬浮（图4）。收集悬浮的癌细胞另外培养，大部分仍能正常生长和继续传代。癌细胞在NSF的胞体或突起之间，癌细胞与NSF间结合不紧密，两种细胞间有接触抑制，癌细胞很少把间质细胞覆盖；在间质细胞融合成片的区域，几乎看不到癌细胞。部分癌细胞形态有变化，除上皮样外，还有梭形和星形。NSF的胞浆及突起vimentin染色均呈阳性，部分癌细胞的核周围也有少量阳性区（图5）。随着培养时间的延长，贴壁的癌细胞逐渐减少，8～9 d后几乎只剩下NSF，而此时的NSF突起明显增多加长，类似TSF，但胞体仍为梭形，不如TSF肥大。　　Tca8113细胞与TSF共培养，TSF呈单个散在生长，胞体肥大，呈星形向周围伸出突起，或呈梭形向一端或两端伸出多个突起，突起呈树枝状分出多级。癌细胞与TSF间结合紧密，两种细胞间无接触抑制，增生活跃的癌细胞先是沿TSF的突起两侧增生，或伸出短小的突起与TSF的突起或胞体相连，增生的癌细胞逐渐覆盖TSF的突起，并最终完全覆盖TSF的胞体，最后覆盖的是细胞核所在的部位。随后TSF的结构溶解消失，只留下百余个癌细胞排列成TSF的形状。TSF胞浆vimentin染色呈阳性，Tca8113细胞vimentin染色呈阴性（图6、7）。3  讨论　　本实验观察了体外Tca8113细胞与NSF和TSF共培养后生长情况的改变，结果发现NSF不利于癌细胞的生长，与癌细胞间有接触抑制，对癌细胞有排斥作用。而TSF明显有利于癌细胞的生长，与癌细胞间无接触抑制，可以作为癌细胞生长的基础和前进的桥梁。　　 越来越多的证据显示在癌的发生过程中, 上皮细胞周围的基质会被“激活”，形成癌相关基质, 然后反过来促进肿瘤的发生与进展[8]。被“激活”的基质最主要的特征是转化生长因子-β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）分泌明显提高[9]，TSF通过自分泌TGF-β使自身发生由成纤维细胞向肌纤维母细胞的表型转换[10]。在本实验中与癌细胞培养后，NSF突起增多变长与TSF相似。　　TSF可通过旁分泌生长因子和改变细胞外基质成分去影响上皮细胞的行为[11-13]。有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的细胞的过程，主要的特征有细胞黏附分子（如E-钙黏蛋白）表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。在本实验中，癌细胞与NSF在培养后，癌细胞可变为梭形和星形，vimentin弱阳性表达。这种表型的转换允许肿瘤细胞摆脱细胞-细胞间连接，而表现得更具侵袭性[14]。这种相互转化在癌细胞与TSF共培养时表现不明显，癌细胞仍保持上皮样，几乎未见vimentin表达。　　以上实验结果说明，癌细胞刚刚浸润或转移到一个新的环境时，其所接触的NSF对它有排斥，但随着癌细胞与间质细胞间的相互影响和转化，TSF成了癌细胞生长的基础，以及向远处移动的桥梁。　　间质细胞及其细胞外基质对癌细胞的生长、浸润、转移演进极其重要，间质细胞可以伴随上皮细胞的癌变而发生转变，甚至早于上皮的转变。在这一过程中最关键的是邻近癌细胞的纤维母细胞，也叫肌纤维母细胞或癌相关纤维母细胞。它们能通过细胞－细胞直接接触、可溶性因子、细胞外基质改变上皮细胞的表型。在多种类型的癌的研究中，包括乳腺癌、肠癌、前列腺癌和肺癌，证实了纤维母细胞能够决定上皮细胞的命运，纤维母细胞可以促进上皮细胞恶变，也可以使癌细胞转化为正常细胞[10]。在口腔鳞癌中，TSF有助于癌细胞逃避免疫监视[15]。基于以上发现在肿瘤治疗过程中TSF有望成为抗肿瘤治疗的新靶点。【参考文献】[1] Van den Hooff A. 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