不同剂量地塞米松对小鼠胚胎腭裂发生的影响
发表时间：2009-10-16 浏览次数：656次
不同剂量地塞米松对小鼠胚胎腭裂发生的影响作者：何苇,卢胜军,李承浩,蒙田,周京琳,石冰 作者单位：1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学 四川 成都 610041；2.四川大学华西口腔医院唇腭裂外科 四川 成都 610041 【摘要】 目的 确立地塞米松诱导小鼠腭裂模型的最佳剂量，为进一步相关实验提供可靠模型。方法 分别将特定孕期的C57BL/6J雌鼠随机分为5组，即对照组和实验Ⅰ～Ⅳ组。E10-E12时，每天早上8时给予对照组每只孕鼠腹腔注射生理盐水0.1 mL，实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组孕鼠分别腹腔注射地塞米松12.0、6.0、3.2、1.6 mg/kg。于E17.5时处死孕鼠，称量并q计算孕鼠和胚胎的体重，记录胚胎吸收数及胚胎腭裂数。结果 实验Ⅲ、Ⅳ组孕鼠与对照组孕鼠的体重的差异具有统计学意义（P<0.05），但其胚胎吸收数和胚胎腭裂数的差异无统计学意义（P>0.05）；实验Ⅰ、Ⅱ组与对照组孕鼠胚胎腭裂发生率的差异具有统计学意义（P<0.05）；实验Ⅰ组与对照组孕鼠胚胎吸收率的差异具有统计学意义（P<0.05）；各组间胚胎体重的差别无统计学意义（P>0.05）。结论 6.0 mg/kg地塞米松是建立C57BL/6J胎鼠腭裂模型的适宜剂量。 【关键词】 腭裂,地塞米松,小鼠 AEffect on incidence of cleft palate interfered by different dose dexamethasone in mice embryo HE Wei1,2, LU Sheng-jun1, LI Cheng-hao1, MENG Tian1,2, ZHOU Jing-lin1, SHI Bing1,2. （1. State Key Laboratory of OralDiseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Cleft Lip and Palate Repair, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 10041, China） [Abstract] Objective To define the optimal dose of dexamethasone induced cleft palate in C57BL/6J mice and to provide a reliable model of cleft palate for further study. Methods Pregenant mice at specific period were di-vided into five groups randomly, that were control group and experimental groups of Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ. The mice of the control group were injected sodium chloride 0.1 mL and the mice of experimental Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ groups were injected dexamethasone of 12.0, 6.0, 3.2, 1.6 mg/kg respectively at 8:00 am on embryo 10 to embryo 12. To weighq pregnant mice and embryos and record the number of embryonic resorption and cleft palate after pregnant miceq were killed on embryo 17.5. Results Weight of pregnant mice was significantly different（P<0.05）, but the number of embryonic resorption and cleft palate had no significant difference between control group and experimental Ⅲ,Ⅳgroups（P>0.05）. Incidence of embryonic cleft palate had significant difference between control group and experimentalⅠ,Ⅱgroups（P<0.05）. However, incidence of embryonic resorption increased ignificantly in experimenqtalⅠgroup（P<0.05）. There was no difference in embryonic weight among each group（P>0.05）. Conclusion 6.0 mg/kgis the optimal dose of dexamethasone to induce cleft palate in C57BL/6J mice. [Key words] cleft palate； dexamethasone； mice 非综合征型唇腭裂是人类最常见的先天畸形之一，我国新生儿的发病率约为13.46/10 000～14.51/10 000[1]。研究显示糖皮质激素、药物、烟草、酒精等与唇腭裂的发病均有一定关系，唇腭裂患儿的母亲在其怀孕期间应用这些药物/物品明显高于正常儿童母亲在怀孕时期的应用[2]。为了阐明这些物质在唇腭裂发生中所起的作用以及作用机制，往往需要借助于动物实验，由于近交系小鼠基因背景单一，可消除基因背景之间的个体差异，而且腭的生长发育与人十分相似，繁殖周期短，所以大多选择近交系小鼠进行实验。在建立药物诱导的小鼠唇腭裂模型时，致畸剂的剂量十分重要，既使胚胎最大程度的产生唇腭裂，又尽量不影响母鼠的正常繁殖和胚胎的正常生长，以及致畸剂作用后胚胎不产生重大畸形，避免影响实验结果的分析判断。本研究拟确定建立C57BL/6J小鼠腭裂模型所需致畸剂地塞米松（dexamethasone，DEX）的最佳剂量，为后续实验提供可靠依据。1 材料和方法 1.1 实验动物 SPF级C57BL/6J小鼠购自四川大学华西动物中心，8~10周龄，体重均在20 g以上。 1.2 实验用药 地塞米松购自美国Sigma公司。 1.3 实验方法 1.3.1 小鼠饲养 选取8~10周龄SPF级C57BL/6J小鼠饲养在（25±2） ℃和人工调控12 h昼夜循环条件下，任意给予水和食物。将未交配生育过的雌雄小鼠以2∶1的比例合笼，次日晨检查雌鼠，有阴道栓者记为胚胎0天（embryo 0，E0），标记并称体重，取出单独饲养。E10时称重见阴道栓的雌鼠，体重增加小于2 g者判定为假孕，取出重新交配，体重增加大于或等于2 g者判定为受孕，用于后续实验。 1.3.2 分组及给药 将25只孕鼠随机分为5组，即对照组和实验Ⅰ～Ⅳ组，每组5只孕鼠。E10—E12时，每天早上8时给予对照组每只孕鼠腹腔 注射生理盐水0.1 mL，实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组孕鼠分别腹腔注射DEX 12.0、6.0、3.2、1.6 mg/kg。 1.3.3 标本收集和分析 E17.5时称重孕鼠后断颈法处死孕鼠，完整取出胚胎，并称量总胚胎重量，记录胚胎总重量及母鼠增加体重（E17.5孕鼠体重-胚胎总重量-E10孕鼠体重），并计算每个胚胎的体重（胚胎总重量/胚胎个数）。完整分离胚胎和子宫，将子宫放置于10%硫化铵溶液中，4 h后胚胎植入点染为蓝色，记录胚胎吸收数（植入点数-胚胎数）。取出的胚胎剪掉下颌和舌，在体式显微镜下观察胚胎腭裂发生情况。 1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件对孕鼠及胎鼠体重变化进行方差分析。对胚胎吸收率及腭裂发生情况进行χ2检验。P＜0.05表示有统计学意义。2 结果 2.1 孕鼠体重的变化 实验组E17.5孕鼠增加体重均比对照组E17.5孕鼠少。对照组孕鼠增加体重最多，为（4.18±1.10） g；实验Ⅰ组其次，为（3.45±0.82） g；实验Ⅳ组孕鼠增加体重最少，为（1.86±1.30） g。对照组和实验Ⅰ、Ⅱ组孕鼠增加体重之间比较，其差异无统计学意义（F=1.746，P>0.05），但与实验Ⅲ、Ⅳ组比较，其差异具有统计学意义（F=7.821，P<0.05）。实验Ⅲ、Ⅳ组孕鼠增加的体重低于对照组和实验Ⅰ、Ⅱ组。 2.2 胎鼠体重变化分析 地塞米松处理孕鼠后，胎鼠体重与地塞米松剂量呈反比，对照组胎鼠体重最大，为（1.18±0.12） g，实验Ⅰ组胎鼠体重最小，为（1.02±0.50） g，随着地塞米松剂量增加胎鼠体重降低，但它们之间的差异无统计学意义（F=2.597，P>0.05）。 2.3 胚胎的吸收率 表1显示对照组和各实验组小鼠胚胎吸收数和植入数，对照组和实验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间比较，小鼠胚胎吸收率的差异无统计学意义χ2=3.758，P>0.05），但与实验Ⅰ组比较，其差异具有统计学意义（χ2=7.559，P<0.01）。 2.4 胚胎腭裂发生情况 胚胎腭裂发生的情况见表2。 如表2的数据所示，对照组胎鼠的腭裂发生和实验Ⅲ、Ⅳ组比较，其差异无统计学意义（χ2=0.808，P>0.05），但与实验Ⅰ、Ⅱ组比较，其差异具有统计学意义（χ2=20.057，P<0.01）。在给予孕鼠注射6.0 mg/kg和12.0 mg/kg地塞米松后，胎鼠的腭裂发生率明显上升。E17.5，发生腭裂的小鼠继发腭完全裂开，原发腭融合，未见有唇裂发生，未融合的腭板形状偏小。3 讨论 糖皮质激素对多种生物具有发育毒性，胸腺、脾、肾上腺等都对地塞米松的作用敏感，应用地塞米松后这些器官的重量减轻[3]。并且糖皮质激素能诱导多种实验室动物畸形，在啮齿类动物中最常见的致畸效应是腭裂[4]，通过影响腭胚突的细胞增殖和分化，导致腭胚突变小，上抬延迟，两侧腭板不能在中线位置接触而诱发腭裂[5]。 在孕期不同的时间给予小鼠地塞米松，诱导小鼠胚胎产生不同的畸形。在E9—E14能诱发胚胎腭裂，还能诱发胚胎波状肋骨[3]。这个时期 小鼠腭胚突生长发育的关键阶段，地塞米松作用后扰乱了腭的正常生长发育，导致腭裂发生。小鼠E10—E12正是腭从上颌突延伸、在舌两侧生长的关键阶段，并为随后的腭上抬和融合做准备。在这个时期给予小鼠注射糖皮质激素后，腭板细胞的有丝分裂显著下降，导致其后的细胞增殖下降，发生腭裂[6]。本实验在小鼠E10—E12给予地塞米松，扰乱了腭胚突细胞的正常增殖，导致腭胚突上抬延迟、过小，无法在中线接触而发生腭裂。腹腔给予小鼠12.0、6.0、3.2、1.6 mg/kg地塞米松后，腭裂发生率依次为38.10%、37.50%、7.69%、3.33%，随着地塞米松剂量的增加，小鼠胚胎腭裂发生率也相应增加。对照组小鼠胚胎的腭裂率为4.55%，和注射地塞米松3.2 mg/kg和1.6 mg/kg后的小鼠胚胎腭裂发生率比较，其差异无统计学意义（P>0.05），但和注射地塞米松12.0 mg/kg和6.0 mg/kg后的小鼠胚胎腭裂发生率比较，其差异具有统计学意义（P<0.05），说明剂量为12.0 mg/kg和6.0 mg/kg地塞米松能诱导出小鼠腭裂模型。同时，C57BL/6J小鼠在正常情况下不会产生自发腭裂，但注射生理盐水后小鼠胚胎却产生腭裂，说明针刺产生的疼痛等反应也会引发母体和胚胎发生一定变化而诱发腭裂产生，但这还需进一步验证。 有研究显示，随着地塞米松剂量的增加，母鼠和胚胎的体重呈剂量依赖性下降，胚胎吸收率上升，腭裂发生率却没有明显变化[4]。本实验中12.0 mg/kg组，小鼠胚胎的吸收率比对照组高，其差异具有统计学意义（P<0.05），该剂量地塞米松影响了小鼠胚胎的正常生长发育，胚胎植入后发生吸收，其他剂量组对小鼠胚胎的吸收没有显著影响（P>0.05）。实验组和对照组小鼠胚胎的体重虽然随着地塞米松剂量的增加有下降趋势，但二者之间差异无统计学意义（P>0.05），说明即使地塞米松剂量达到12.0 mg/kg，对没有发生吸收的胚胎在子宫内继续的生长发育没有重大影响。 本实验的结果显示，母鼠体重没有随着地塞米松剂量的增加而降低，与地塞米松的剂量并不呈负相关。低剂量组（1.6、3.2 mg/kg）孕鼠增加的绝对体重低于正常对照组和高剂量组（12.0、6.0 mg/kg）孕鼠增加的绝对体重（P<0.05），似乎只有低剂量地塞米松对孕鼠的体重有较大影响，这和大鼠对地塞米松的反应有差别。小鼠基础体重较小，且实验动物为商品化小鼠，其孕前体重没有统一化；孕鼠处死前的饮食状况、每窝胚胎个数及体重等因素对母鼠体重影响较大，所以出现不同的反应。本研究的结果表明，一定剂量的地塞米松既能有效诱导小鼠胚胎产生腭裂，又不影响孕鼠的正常生长繁殖和胚胎在子宫内的正常生长发育，能建立比较稳定安全的腭裂动物模型，可保证后续实验有效应用。【参考文献】[1] 朱 军. 出生缺陷及其监测[J]. 中国实用妇科与产科杂志, 2002, 9（18）：513-514.[2] Cockell A, Lees M. Prenatal diagnosis and managementof orofacial clefts[J]. Prenat Diagn, 2000, 20（2）：149-151.[3] Hansen DK, LaBorde JB, Wall KS, et al. Pharmacoki-netic considerations of dexamethasone-induced develop-mental toxicity in rats[J]. Toxicol Sci, 1999, 48（2）：230-239.[4] LaBorde JB, Hansen DK, Young JF, et al. Prenatal dexa-methasone exposure in rats: Effects of dose, age at expo-sure, and drug-induced hypophagia on malformations and fetal organ weights[J]. Fundam Appl Toxicol, 1992, 19（4）：545-554.[5] Abbott BD, Buckalew AR. Embryonic palatal responses to teratogens in serum-free organ culture[J]. Teratology,1992, 45（4）：369-382.[6] Jelínek R, Dostál M. Inhibitory effect of corticoids on the proliferative pattern in mouse palatal processes[J].Teratology, 1975, 11（2）：193-198.
