双向电泳分析维生素D对牙髓细胞分化的影响
发表时间：2009-10-12 浏览次数：678次
双向电泳分析维生素D对牙髓细胞分化的影响 作者：聂敏 边专 樊明文 赵心臣 Mikael Wendel ［摘要］ 目的：用双向电泳分析牙髓细胞分化过程中产生或分泌的新蛋白质。方法：在体外培养牙髓细胞，给予一定时间的1,25-双羟维生素D3，促使牙髓细胞分化，结合双向电泳技术分析细胞分化前后蛋白质合成、分泌的变化。结果：pH4-8 和相对分子量MW 20~90 kD范围的蛋白斑点分布较多。双向电泳凝胶图像分析软件ImageMaster 2D Platium比较分析，给予维生素D孵育24 h后，检测到77个新的蛋白点，同时有17个蛋白点消失。结论：维生素D促使牙髓细胞分化，并产生或分泌了一些新的蛋白质，维生素D和这些蛋白质对牙齿的发育、矿化的过程起调节作用。 ［关键词］ 双向电泳 维生素D 牙髓细胞 发育 Studies of New Proteins Involved in Development of Rat Dental Pulp Cells. NIE Min, BIAN Zhuan, FAN Ming-wen, et al. School of Stomatology, Wuhan University, Wuhan 430079 ［Abstract］Objective: The purpose of this paper is to study new proteins produced or secreated by rat dental pulp cells in the course of development. Methods: Isolated of rat dental pulp cells were cultured in vitro. Two groups were incubated with vitamin D for 3h and 24h respectively and one group was set as control. Two-dimensional electrophoresis was used to analysis the proteins of cell culture supernatant. Results: The differential protein expression analysis found that 77 protein spots were specifically detected, and 17 protein spots disappeared in the group treated with Vit D for 24 h. Most spots were focused in the area of pH4-8 and 20-90 kD. Conclusion: It is concluded that Vit D may play a role in the development of rat dental pulp cells, which produce some new proteins certified by 2-D electrophoresis. It is suggested that some new proteins have been produced or secreted by rat dental pulp cells in the course of development.［Key words］ 2-D electrophoresis Vitamin D Dental pulp cells Development 双向电泳第一相即等电聚焦凝胶电泳，依据蛋白质分子的等电点进行分离：在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中，如果偏离蛋白质的等电点，带有电荷的蛋白质分子可以在电场中移动，一直到蛋白质迁移到其等电点位置时，其净电荷为零，在电场中不再移动。双向电泳第二相即梯度SDS-PAGE电泳，依据蛋白质的分子量进行分离。最终，样品经过电荷和质量两次分离后，得到点状电泳结果，分离准确精细。所以，双向电泳是蛋白质组学的重要研究方法之一。随着固定pH梯度胶条的出现，双向电泳(2 -DE) 已经成为蛋白质组研究中的核心技术之一； 双向电泳/质谱蛋白质组解决方案能够在整体水平上，大规模、快速地鉴定复杂蛋白样品［1］。 牙齿发育过程中，基因表达的调控受到多种激素的调节， 如转录因子、维生素D等［2］。成骨细胞、成牙本质细胞、成牙骨质细胞都表达1,25-双羟维生素D3的受体（VDR）［3］，所以，VitD直接影响了牙釉质、牙本质、牙骨质的矿化基质的合成。体外给予VitD，增加骨钙素（ostocalcin）的合成、转录、翻译［4］。本实验旨在体外培养牙髓细胞，给予一定时间的VitD，结合双向电泳技术分析给予VitD促使牙髓细胞分化过程中蛋白质合成、分泌的变化。1 材料与方法 1.1 细胞培养 取新生小鼠20只，断颈处死，分离上下颌骨。在解剖显微镜下，取出第一、第二磨牙，分离出牙髓，将牙髓组织暂时存放于含2% Antibiotic-antimycotic (AB-AM, Sigma, US)的PBS中。在4 ℃下完成所有样本后，立即转入3 mL消化液中(0.25% trypsin, 0.5% collagenous A, 0.5% VitC, PBS, pH 7.2)，37 ℃水浴45 min，每15 min振摇试管。然后加入等体积的细胞培养液(90% MEM-alpha Medium,GIBCO BRL,US；10% 小牛血清;5 μg/mL庆大霉素; 50 μg/mL Vit C; 10-6 M 地塞米松)。800 r/min离心沉淀细胞，去上清，加入细胞培养液，重悬细胞。将细胞转入T-75培养瓶，37 ℃、5% CO2培养过夜。次日，分3组，每组3份，共9瓶。观察细胞生长情况，按时更换培养液。第8天，第1组细胞作为对照组；第2组细胞给予10-7 M 维生素D，孵育3 h；第3组细胞给予10-7 M VitD，孵育24 h。最后，离心取细胞培养液，0.22 μm滤器过滤，备用。 1.2 双向电泳 将各组细胞培养液上清用DM-10 filter (Millipore，美国 )和Ultrafiltration membrame (直径43 mm)浓缩至1 mL，各取100 μL，加入600 μL 95%乙醇和50 mmol/L醋酸钠以沉淀蛋白质，10 000 r/min离心30 min，去上清，留沉淀。准备Rehydration Solution (8M尿素, 2% CHAPS,溴酚兰痕量)，且临用前每2.5 mL加入7 mg DTT（Sigma,US）和50 μL IPG Buffer（Pharmacia, Sweden）。42 ℃干燥沉淀后，各加入新鲜配制的250 μL上述缓冲液，置于Rehydration slot中，铺上IPG胶条（IPG strip,pH 3-10,Pharmacia,Sweden）和IPG Cover buffer，过夜。去离子水冲洗IPG strip ，滤纸吸去多余水分，铺在带冷凝装置的水平电泳槽上，20 ℃下33 450 Vh高压电泳17 h。 完成第一相等电聚焦凝胶电泳后，取出IPG strip，置于含1%DTT的SDS平衡缓冲液中（50 mM Tris-HCl,pH8.8,6M Urea,30% Glycerol,2% SDS,溴酚兰痕量），振摇15 min。再置于含2.5% Iodoacetamide(Sigma, US)的SDS平衡缓冲液中，振摇15 min。备4%~16% SDS-PAGE梯度胶，将IPG strip和分子量Marker放在上方，30 mA电泳。 1.3 染色 电泳后，Coomassie Blue结合硝酸银染色。先用Coomassie Blue染，然后脱色过夜，再继续银染，将胶放在200 mL Fixer(40%乙醇、10%醋酸)中洗涤，加入5%甲醇、7%醋酸孵育30 min，1% Potassium ferricyanide和1.6% Na2S2O3?5 H2O中孵育15 min，去离子水洗膜，加入0.1% AgNO3孵育30 min，3% Na2CO3和0.05% formaldehyde显色，5%甲醇、7% 醋酸终止反应。 1.4 分析 双向电泳凝胶图像分析软件ImageMaster 2D Platium进行分析。2 结果 图1示对照组没有维生素D的双向电泳银染结果，图2是第3组给予维生素D孵育24 h的双向电泳银染结果，图3是第2组给予维生素D孵育3 h的双向电泳银染结果。从左至右，pH值从3~10 ，逐渐偏碱。pH4~8 和相对分子量MW 20~90 kD 范围的蛋白斑点分布较多。双向电泳凝胶图像分析软件ImageMaster 2D Platium比较分析1 093个点，给予维生素D孵育24 h后，检测到77 个新的蛋白点，同时有17 个蛋白点消失。这些蛋白质是对照组没有的，偏酸性。说明了维生素D对牙髓细胞产生的影响，确实促使牙髓细胞产生或分泌了一些新的蛋白质。 图1 － 图2 略 图3 给予VitD孵育3 h后的双向电泳（银染）结果 略 3 讨论 由于蛋白质的分子量和所带净电荷是两个彼此不相关的重要性质，而双向电泳同时利用了这两个性质的差异分离蛋白质，因此分离能力强大，可以快速准确地发现和鉴定新的蛋白质。我们正是利用了其高分辨能力证实了维生素D对牙髓细胞的影响，它促使牙髓细胞产生或分泌了一些新的蛋白质。 在组织形成和矿化过程中细胞分泌非胶原蛋白到细胞外基质。普遍认为，除了激素的作用之外，非胶原蛋白对骨和牙齿的发育、形成有关键作用［5，6］。由于成骨细胞、成牙本质细胞、成牙骨质细胞都表达1,25-双羟维生素D3的受体（VDR），所以我们分离刚出生小鼠的牙髓细胞，它们尚未完全分化，让维生素D促进其分化。正在发育和分化阶段的牙髓细胞可能会产生一些新的蛋白质，这些蛋白质对牙齿的发育、矿化的过程会有一定作用。从我们的结果发现这些1 093个点中，大部分蛋白点分布在pH4~8 和相对分子量MW 20~90 kD 的范围内。维生素D孵育24 h后，检测到77 个新的蛋白点，这些蛋白质是对照组没有的。 目前知道VitD增加骨钙素（ostocalcin）的合成、转录、翻译。需要进一步确认新产生了哪些蛋白质。至少我们的实验证明这些蛋白质有几十种之多，且分子量高，相对偏酸性。我们需要进一步了解这些蛋白质的种类、性质、功能特点，可以结合液相色谱、质谱仪、毛细管电泳分析确认它们［8］。参考文献 ［1］ Issaq HJ. The role of separation science in proteomics research ［J］. Electrophoresis, 2001,22∶3 629-3 638 ［2］ Berdal A, Lezot F, Nefussi JR, et al. Mineralized dental tissues: a unique example of skeletal biodiversity derived from cephalic neural crest ［J］. Morphologie, 2000, 84∶5-10 ［3］ Davideau JL, Papagerakis P, Hotton D, et al. In situ investigation of vitamin D receptor, alkaline phosphatase, and osteocalcin gene expression in oro-facial mineralized tissues ［J］. Endocrinology， 1996, 137∶3 577-3 585 ［4］ Bronckers AL, Price PA, Schrijvers A, et al. Studies of osteocalcin function in dentin formation in rodent teeth ［J］. Eur J Oral Sci, 1998, 106∶795-807 ［5］ 陈智, 樊明文, 张旗, 等.骨连结蛋白在大鼠正常牙髓和牙髓修复中的基因表达［J］.武汉大学学报（医学版）,2001,22∶193-195 ［6］ 樊明文, 边专.牙本质非胶原蛋白及其对成牙本质细胞的诱导［J］.中华口腔医学杂志, 1997,32∶124-125 ［7］ 张旗,樊明文,边专,等.骨唾蛋白及骨桥素在修复性牙本质形成中免疫组化定位的实验［J］.中华口腔医学杂志, 2002,37∶323 ［8］ 聂敏, 边专,樊明文,等.鼠矿化组织中非胶原蛋白的提取和层析分离［J］.口腔医学研究,2003,19（3）∶170-172
