兔VX2舌鳞癌移植瘤模型3种建立方法的比较

兔VX2舌鳞癌移植瘤模型3种建立方法的比较作者：田军,廖贵清,刘海潮,李传真,李清,王敬旭,杜日昌,张同韩    作者单位：1.中山大学附属口腔医院 口腔颌面外科，广东 广州 510055；2.广东省韶关市第一人民医院 病理科，广东 韶关 512000    【摘要】  目的 采用3种不同移植瘤方法建立稳定的兔VX2舌鳞癌移植瘤模型，并对这3种方法建立的模型的生物学特性进行比较。方法 将72只新西兰大白兔随机分成3组，每组24只，分别用瘤组织块植入法、改良瘤细胞悬液注入法及瘤细胞悬液注入法植于兔舌侧缘中1/3黏膜下，建立兔舌鳞癌的移植瘤模型。观察和比较3种方法所建立的模型的肿瘤生长状况、成瘤率和自发转移发生率。结果 瘤组织块植入组、改良瘤细胞悬液注入组、瘤细胞悬液注入组的成瘤率分别为83.3%、91.7%、33.3%，局部淋巴结转移率分别为71.4%、100.0%、37.5%，肺转移率分别为35.7%、81.3%、0；3种方法建立的兔VX2舌鳞癌移植瘤模型的组织学形态均符合中分化鳞状细胞癌特征。结论 3种方法建立的移植瘤模型均较接近人舌鳞癌自然生长过程。其中，改良瘤细胞悬液注入法建立的动物模型，因成瘤率高、转移率高、同期瘤体大小差异较小，更适合于舌鳞癌研究。    【关键词】  舌癌,VX2肿瘤细胞株,动物模型　　A comparison of three methods in establishing transplanted model of VX2 tongue carcinoma in rabbits TIAN Jun1, LIAO Gui-qing1, LIU Hai-chao1, LI Chuan-zhen1, LI Qing1, WANG Jing-xu1, DU Ri-chang2, ZHANG Tong-han1. （1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery，Stomatological Hospital，Sun Yat-Sen University, Guangzhou510055, China; 2. Dept. of Pathology, Shaoguan Frist People′s Hospital, Shaoguan 512000, China）　　[Abstract] Objective  To establish transplanted models of VX2 tongue carcinoma in rabbits by three methods and compare these models. Methods  After establishment of VX2 tumor-bearing rabbits, 72 New-Zealand white rabbits were randomly divided into 3 groups. Intact tumour tissue, modified tumour cell suspension, tumour cell suspension were respectively injected into the middle-third lateral border of the tongues of rabbits in 3 groups to induce transplanted VX2 tongue carcinoma. The histological features, the tumour-take rates and the metastasis rates of the 3 models were observed. Results  The tumour-take rate of 3 models were 83.3%, 91.7% and 33.3% respectively; the lymph node metastasis rates were 71.4%, 100.0% and 37.5% respectively; the lung metastasis rates were 35.7%, 81.3% and 0 respectively. The histological features of the transplanted VX2 tongue carcinoma of 3 models were all consistent with those of moderately differentiated carcinoma. Conclusion  The biological properties of the transplanted VX2 tongue carcinoma of 3 models is much alike to tongue carcinoma in humans. The model established with modified tumor cell suspension is considered to be more suitable for tongue cancer study.　　 [Key words]  tongue carcinoma； VX2 tumor cell strain； animal model　　由于舌体具有丰富的淋巴及血液循环，机械运动频繁，舌鳞癌常发生早期淋巴结转移，且转移率较高[1-2]，故成为舌鳞癌防治的难点[3]。目前，瘤组织块植入法建立的兔VX2舌鳞癌移植瘤模型被认为是较理想的舌鳞癌研究模型[4-7]，但本课题组在前期的实验中发现，该法无法精确地控制植入的活细胞数，导致同一时期内各荷瘤动物的肿瘤体积差异较大，而瘤体大小又与肿瘤的转移密切相关[8-9]，直接影响对舌鳞癌生物学特性的研究和对各种舌鳞癌治疗策略的疗效评估。因此，本实验希望通过改良瘤细胞植入的方法优化兔VX2舌鳞癌移植瘤模型。1  材料和方法　　1.1  实验动物　　纯种新西兰大白兔72只，雌雄不限，体重2.8~3.2 kg，由中山大学医学部实验动物中心提供及饲养（合格证编号：粤检证字2003A034）。　　1.2  瘤株　　兔VX2鳞状细胞癌瘤株，由中山大学附属第二医院超声科文艳玲惠赠；培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI-1640完全培养液，置于5%CO2恒温孵育箱，0.02%EDTA常规传代。　　1.3  实验方法　　1.3.1  麻醉方法  本实验动物皆用3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉给药，全身麻醉下完成操作，　　所有动物术前禁食12 h。待动物濒临死亡时处死，解剖观察。　　1.3.2  荷瘤种兔的制作  取冻存VX2瘤细胞悬液，复苏，离心5 min，加入Hanks液轻轻吹打混匀，反复洗涤2~3次；除去上清液，加入RPMI-1640完全培养液，台盼蓝染色并做活细胞计数，调整到每毫升5×107个活细胞密度；动物麻醉后，仰卧位固定，8%Na2S脱毛，消毒后将1 mL细胞悬液经皮注入兔后腿内侧肌肉，4周左右在接种部位扪及一直径为3~4 cm的实质性包块，即制成荷瘤种兔。　　1.3.3  实验动物分组  将兔随机分成3组，每组24只。第1组（瘤组织块植入组）：切取荷瘤兔肿瘤边缘生长旺盛的鱼肉样组织，仔细剔除周围肌肉结缔组织及中心坏死组织，Hanks液冲洗2遍，用锋利眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块（含有106~108个活细胞），置于含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI-1640培养液中备用。用套管针经舌黏膜下隧道，于舌侧缘中1/3处推入1个瘤组织块，缓慢退出针头，并用无菌纱布块压迫针孔数分钟。术毕肌注青霉素40万U/只和庆大霉素4万U/只，每天1次，连续5 d，预防感染以提高成瘤率。　　第2组（改良瘤细胞悬液注入组）：新鲜瘤组织块的准备同瘤组织块植入法，然后继续用锋利眼科剪剪成细糊状，加入适量Hanks液并过200目金属细胞筛，RPMI-1640完全培养液重悬2次，收集单细胞悬液，调整到每毫升5×108个细胞密度，用5号皮试细针头在种植部位前约1 cm处入针，于舌侧缘中1/3舌黏膜下潜行注入0.1 mL瘤细胞悬液，以防止瘤细胞渗漏。术后处理同上。第3组（瘤细胞悬液注入组）：收集体外传代培养的快速生长期VX2癌株细胞，直接注射至舌侧缘中1/3舌黏膜下（5×107个/只），基本程序与改良细胞悬液法相同。术后处理同上。　　1.3.4  观察指标  1）成瘤率；2）自然生存期；3）移植瘤体积：移植后定期用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积（V）＝1/2×ab2（a、b分别为肿瘤最大和最小径），肿瘤体积的变异系数（C）=标准差（S）/瘤体体积均值（V）；4）肿瘤大体及镜下形态；5）颈淋巴结及肺转移率。　　1.3.5  统计学分析  3组间成瘤率、颈淋巴结转移率和肺转移率的比较采用?掊２检验，利用SPSS 11.5统计软件对数据进行统计分析。2  结果　　2.1  移植成瘤率比较  改良瘤细胞悬液注入组的成瘤率为91.7%，在3组中最高，与瘤组织块植入组的成瘤率（83.3%）比较，差异无统计学意义（P>0.05）；瘤细胞悬液注入组的成瘤率为33.3%，与上述2组比较，差异有统计学意义（P<0.001，表1）。　　2.2  移植瘤转移率比较     改良瘤细胞悬液注入组的颈淋巴结转移率为100.0%，肺转移率为81.3%，均为3组之中最高，与瘤组织块植入组（颈淋巴结转移率71.4%，肺转移率35.7%）及瘤细胞悬液注入组（颈淋巴转移率37.5%，肺转移率0）比较，差异均有统计学意义（P<0.001，表1）。　　2.3  肿瘤生长特性比较　　瘤组织块植入组与改良瘤细胞悬液注入组的潜伏期无明显差异，均于移植后1周内成瘤；成瘤后2种方法在生长速度上也没有明显的差别（图1），均可于术后2~3周左右扪及同侧颈部直径1~2 cm、质地较硬的肿大淋巴结；生存期分别为（39.3±7.7） d，28~52 d；（33.8±5.0） d，28~39 d。瘤细胞悬液注入组的成瘤时间较前2组延迟2周左右，生长速度与前2组相似（图1），术后4~5周方可触及同侧肿大颈淋巴结；自然存活时间为（53.8±3.5） d，49~56 d。所有荷瘤动物于肿瘤晚期均出现拒食，极度消瘦，活动受限并伴有呼吸急促、发绀，最后全身衰竭而死亡。　　2.4  大体形态观察 　　3组肿瘤大体形态相似。原发灶：瘤体呈灰白色，类椭圆形，结节状，稍欠规则，边界尚清晰，无包膜，质较硬，剖面呈鱼肉状，其内可见丰富的供瘤血管；早期移植瘤呈局限性生长，表面光滑，剖开见球形瘤结节，无包膜；晚期瘤体越过中线，甚至占据舌体大部，中心坏死，黏膜溃烂，气味腐臭（图2A）。转移灶：可见多个肿大颈深淋巴结，未突破包膜，与周围组织无粘连，质较硬（图2B）。肺组织表面可见灰白色粟粒状瘤结节呈弥散性分布，部分融合（图2C）。  　2.5  组织病理学观察 　　3组肿瘤组织病理学表现相似。原发灶（图2D）：低倍镜下见瘤结节被舌肌包绕，癌细胞呈实体巢状紧密排列，浸润周围组织，较大的瘤结节中央，癌细胞有不同程度的变性、坏死，周围组织中可见散在小癌巢，邻近小血管、淋巴管内可见癌栓形成；新生微血管丰富，多数呈不规则增生；结缔组织较少，间质分界不清，其内可见淋巴细胞、浆细胞浸润。高倍镜下未见角化珠，癌细胞深染，大小、形态不一；细胞质丰富，呈淡红染色；核大畸形，核膜清楚，染色质颗粒较粗，核仁明显，可见多个核仁，病理核分裂相多见。以上提示为中分化鳞状细胞癌。颈淋巴结及肺转移灶组织病理学表现与原发灶一致（图2E、2F）。3  讨论　　理想的舌鳞癌动物模型应能模拟人类舌鳞癌的局部浸润性生长和较高的转移率，而来源于兔乳头状瘤衍生鳞癌的VX2瘤株，具有肺及局部淋巴结的高转移性[10]，而且生物学性质稳定，易于传代，可移植到兔的多种组织器官形成相应的移植瘤模型[4-7]。本实验参考文献[5-6，11]分别采用3种方法建立的兔VX2舌鳞癌移植瘤模型的组织学特征与移植于兔其他部位的VX2肿瘤基本一致，在舌体内呈浸润性生长并向周围侵袭、扩散，符合中分化鳞状细胞癌特征。　　目前，兔VX2移植瘤成瘤效果仍未令人满意。Chen等[6]比较几种兔VX22肝移植瘤建模方式后认为，瘤组织植入法可以避免瘤细胞的自发播散和泄漏，保证了移植瘤细胞的数量和密度，所以建模效果较为可靠。学者认为，体积为1 mm3左右的瘤组织块可保证瘤细胞获得充足营养，还可减少宿主对肿瘤细胞的免疫攻击以及细胞间的相互作用，故成瘤率较高。但是，他们[6，8]都认为，尽管尽量将瘤块剪修成相同大小，仍无法对瘤块内的肿瘤细胞精确计数以控制植入数量，常导致移植瘤生长的速度和大小不一，直接影响对移植瘤生物性质、转移率、药物效果等的研究。本实验中，瘤组织块植入法的成瘤率（83.3%）较高，但同期肿瘤体积变异系数几乎为其余两组的3倍左右，与文献报道基本一致。　　传统的瘤细胞悬液注入法常采用体外传代培养的快速生长期瘤株细胞直接注入动物体内，目前这种方法的成瘤率仍较低。多数学者认为，可能是体外多次传代使瘤株恶性程度减弱，加上以酶消化法制作细胞悬液，破坏了细胞与亲本细胞间的相互关系，使这些细胞成瘤能力减低[12-15]。在本实验中，瘤细胞悬液注入法的成瘤率最低（33.3%），与其他2组有显著性差异（P<0.001），而且生长较其他2组推迟了2周左右。　　本研究中的改良瘤细胞悬液注入法采用新鲜瘤组织直接制成单细胞悬液注入动物体内，避免了体外多次传代对细胞生物特性的影响，而且在单细胞悬液制备过程中避免了酶消化处理，未破坏细胞与亲本细胞间的相互关系，也保护了细胞表面结构，从而保持了癌细胞的恶性生物学性质，成瘤率达91.7%，为3组中最高。另外，虽然这种方法的成瘤率与瘤组织块植入组（83.3%）之间无显著性差异，但由于可以精确控制瘤细胞植入数量，同期肿瘤体积变异系数远低于瘤组织块植入组，故可为舌鳞癌生物学研究、治疗策略效果评估等提供必要的基础。　　本实验中，改良瘤细胞悬液注入组的局部淋巴结转移率（100.0%）及肺转移率（81.3%）均最高，与瘤组织块植入组（71.4%，35.7%）和瘤细胞悬液注入组（37.5%，0）相比差异有统计学意义，并与文献报道基本一致[11，16-17]。原因可能为瘤细胞悬液注入时产生的注射压力增加了瘤细胞进入周围脉管的数量，从而提高了局部淋巴转移率及早期肺转移率，这种现象被称为接种播散现象[18-19]。然而，肿瘤的转移是一个复杂的过程，不单与进入循环的瘤细胞数量有关，还与进入循环的瘤细胞亚群是否具有足够的侵袭转移能力，能否与侵入的组织环境相适应有关系[20]，因此，如上所述，经过体外多次传代培养及酶消化处理的瘤细胞悬液注入法可能降低了瘤细胞的侵袭迁移能力，转移率最低。瘤组织块置入法的转移率低于改良瘤细胞悬液注入法，而且其原发灶同期体积差异较大，影响了对转移率的评估。【参考文献】[1] Woolgar JA, Scott J. 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