重组腺病毒p53转染口腔黏膜异常增生细胞的实验研究

重组腺病毒p53转染口腔黏膜异常增生细胞的实验研究作者：徐波 张松涛 李龙江 韩波 赵洪伟 潘剑    作者单位：口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，四川 成都 610041 　　【摘要】  　　目的 确定重组腺病毒p53（rAd-p53）对口腔黏膜异常增生角化细胞POE-9n转染的最佳滴度及其转染效率，为其在口腔癌前病变领域的进一步研究提供实验依据。方法 采用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告分子的重组腺病毒颗粒rAd-GFP确定口腔异常增生细胞对腺病毒转染的敏感性；以不同滴度的rAd-p53转染口腔异常增生细胞并通过MTT比色检测各组细胞的增殖抑制率；免疫细胞化学染色证实，rAd-p53转入细胞内表达P53蛋白。结果rAd-GFP转染POE-9n细胞在100～500的感染倍数（MOI）范围内转染效率都大于95%, 当MOI为100、200和500时，转染效率升高不明显（r＝0.124，P＞0.05）；在100～500的MOI范围内rAd-p53对POE-9n细胞增殖的抑制效果显著，MOI=100、MOI=200及MOI=500组的生长抑制率在96 h和120 h时间点差异无统计学意义（P＞0.05）；rAd-p53转染后的POE-9n细胞中均呈现P53蛋白的强阳性表达。结论 MOI=100可作为rAd-p53对POE-9n细胞转染的理想滴度，能获得较高且稳定的转染效率。 　　【关键词】  癌前病变 腺病毒 基因治疗　　An experimental study on recombinant adenovirus p53 transfected in oral dysplastic epithelial cells  XU Bo, ZHANG Song-tao, LI Long-jiang, HAN Bo, ZHAO Hong-wei, PAN Jian. （State Key Laboratory of Oral Dieases，Sichuan University, Chengdu 610041, China）　　[Abstract]  Objective  To investigate and evaluate the appropriate virus titer and transfection efficiency of recombi-nant adenovirus p53 into the oral dysplastic epithelial cells（POE-9n） and provide reference for oral precancerosis re-search. Methods  The transfection sensitivity of adenovirus into oral dysplastic epithelial cells was evaluated by the recobinant adenovirus p53 containing green fluorescent protein（rAd-GFP）. Different titre rAd-p53 was transfected into oral dysplastic epithelial cells to evaluate the effects of rAd-p53 on cell proliferation inhibition by MTT assay. The expression of xogenous p53 gene in POE-9n cells was detected by immunocytochemistry. Results  More than 95% POE-9n cells were transfected by rAd-GFP with MOI from 100 to 500 and there was no statistical difference between different MOI values（r=0.124, P>0.05）. It was found that rAd-p53 had significant inhibition effects on POE-9n cell proliferation with MOI from 100 to 500, and there were no significant differences at 96 h and 120 h after the transfection on cell proliferation inhibition（P>0.05）. P53 protein was well expressed in rAd-p53 transfected POE-9n cells. Conclusion  Exogenous p53 can be successfully transfected into POE-9n cells by rAd-p53 and the virus titer of MOI 100 was high enough to ensure efficient transfection.　　[Key words]  pre-cancer lesion； adenovirus； gene therapy　　上皮异常增生是癌前病变疾病的一大病理学特征，伴有上皮异常增生的口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）是最常见的导致口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）的癌前病变[1]，而伴有p53异常的OLK则更易发生恶变[2]。人重组p53腺病毒（recom-binant adenovirus-p53，rAd-p53）是针对p53表达异常的新兴肿瘤基因治疗制剂，为了阐明rAd-p53对口腔黏膜异常增生细胞的增殖抑制作用及其相关机制，并进一步探索rAd-p53用于OLK等癌前病变临床治疗的可能性，本实验通过检测携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）报告分子的重组腺病毒颗粒rAd-GFP转染后荧光分子的表达、MTT实验以及免疫细胞化学染色，以期确定rAd-p53的转染效率，同时也为后期实验提供依据。1  材料和方法  　1.1  细胞株　　口腔黏膜异常增生角化细胞株POE-9n购自美国哈佛大学医学研究所，由重度异常增生型OLK病损细胞建系，为p53表达缺失型细胞株。　1.2  主要试剂及药物　　rAd-p53注射液（深圳赛百诺公司产品），规格为每支1×1012 vp，-20 ℃保存；rAd-GFP由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供，-80 ℃保存；鼠抗人p53单克隆抗体及PV-9000通用型两步法免疫组化染色试剂盒（Santa Cruz公司，美国）。　1.3  荧光倒置显微镜下测定rAd-GFP对POE-9n转染效率　　取对数生长期的POE-9n细胞，制成单细胞悬液后以每孔1×105个接种于6孔培养板中。用rAd-GFP病毒液感染细胞，感染倍数（multiple of infection，MOI）分别为0、25、50、100、200、500，48 h后，荧光倒置显微镜下每孔分别随机选择3个200倍视野计数呈现绿色荧光的GFP阳性细胞数，在可见光下计数该视野内的总细胞数，根据公式计算转染率（转染率＝GFP阳性细胞数/该视野内总细胞数）。　1.4  MTT法检测不同rAd-p53感染强度下POE-9n细胞的增殖抑制率 　　收集生长良好的POE-9n细胞，制成单细胞悬液后，以每孔5×104个接种于96孔板。按MOI取值为0、25、50、100、200、500加入病毒，设MOI取值为25、50、100、200、500为5个rAd-p53组、MOI=0为空白对照组（只加完全培养液），每组设立3个平行孔，在指定时间（24、48、72、96、120 h）弃去培养液，用MTT法进行检测，计算细胞增殖抑制率。　1.5  免疫细胞化学染色检测rAd-p53转染后POE-9n细胞P53蛋白的表达　　收集生长良好的POE-9n细胞，制成单细胞悬液后，以每孔1×105个接种于6孔培养板中。按MOI=100加入rAd-p53，设rAd-p53组、空白对照组，共2组。48 h后吸出培养液，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，干燥后按照PV-9000免疫组化试剂盒说明操作进行免疫组织化学染色。光镜下观察，胞核中出现棕黄色颗粒即为阳性细胞。　1.6  统计分析　　实验数据以x±s表示，所得数据采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。两组间均数的比较采用t检验；两样本率的比较采用?掊２检验或Fisher精确概率法；所有分析均取α=0.05为显著性检验水准。2  结果　2.1  rAd-GFP对POE-9n转染效率　　POE-9n细胞对腺病毒较敏感。随着MOI的增加，染色阳性率亦增加。当MOI取值为25、50、100 时，转染率分别为（36.1±1.56）％、（72.7±1.40）％和（95.6±2.76）％，统计学分析显示腺病毒的转染效率与病毒滴度呈明显的正相关（r＝0.849，P＜0.01）。然而随着病毒滴度的进一步增加，当MOI取值为200、500时，转染率分别为（97.1±4.12）％和（98.9±1.19）％，转染效率升高不明显（r＝0.124，P＞0.05，图1）。因此本实验初步认定MOI=100为以下实验的合适感染滴度，既保证较高的转染效率，又不至因为腺病毒本身对细胞的毒性作用干扰实验结果（图2）。　2.2  rAd-p53转染对POE-9n细胞增殖抑制率的影响　　通过比较各组POE-9n细胞增殖抑制率及绘制细胞增殖抑制曲线发现（表1），随着rAd-p53滴度的增加，各实验组与相同时间点对照组相比，细胞增殖抑制率逐渐增大。其中，MOI=100组、MOI=200组及MOI=500组对POE-9n细胞增殖的抑制效果显著（P<0.05），但从抑制曲线来看，随着时间的积累，该3个亚组的抑制效应增加趋势渐缓（P＞0.05）。在96 h和120 h时间点，3个亚组间在同一时间点的效应差异无统计学意义，即剂量虽增加，但效应不再继续增强。上述实验结果提示：rAd-p53对POE-9n细胞的增殖有抑制作用，并且随着时间的延长和剂量的增加，增殖抑制效果增强，呈现出显著的时间-效应和剂量-效应关系，MOI=100可作为rAd-p53对POE-9n细胞转染的理想滴度。　2.3  rAd-p53转染后POE-9n细胞P53蛋白的表达　　为进一步验证rAd-p53对POE-9n细胞的增殖抑制作用来源于p53基因，本实验利用免疫细胞化学染色技术对rAd-p53转染（MOI＝100）的POE-9n细胞进行P53蛋白检测，结果发现：几乎所有转染后的POE-9n细胞中均呈现P53蛋白的强阳性表达。阳性产物定位于所有POE-9n细胞的胞核及部分细胞质，呈棕褐色颗粒，而空白对照组均未见P53蛋白表达（图3）。3  讨论　　目前的研究证实，超过50%的人类肿瘤中均存在p53基因的异常（包括点突变、等位基因缺失、重排、插入、基因融合等），与肿瘤的发生、发展以及肿瘤患者的预后关系密切[3]，在口腔癌相关的研究中，现已证实p53基因是口腔癌中最常见的突变基因之一，33％～76％的口腔癌和20％的口腔癌前病变中存在p53基因异常[4]。重组p53腺病毒（rAd-p53）即是以外源性野生型p53基因为目的基因，以删除E1区后的2型或5型复制缺陷型腺病毒为运载体，通过基因重组构建的重组体。细胞一次性感染，其进入细胞后不会复制, 也不会整合入宿主细胞基因组DNA，能将野生型p53转染至肿瘤细胞内，发挥诱导凋亡、调节细胞周期等诸多抗癌作用，已成为目前肿瘤基因治疗最热门的候选分子之一。　　腺病毒主要是通过细胞表面的特异性受体柯萨奇/腺病毒受体（coxsackie/adenovirus receptor，CAR）进入细胞，不同类型的细胞对腺病毒的易感性主要由可作用的受体数目决定，常用感染倍数即每个细胞被给予的病毒载体的噬斑形成单位数来实现感染程度的比较[5-6]。因此，在腺病毒相关的基因治疗体外研究中，确定腺病毒对特定细胞的转染效率是后续实验的前提。目前，最简便高效的腺病毒转染效率测定方法即是利用新型报告分子——绿色荧光蛋白（GFP）作为示踪工具，在荧光显微镜下直观地观察转染效果。然而在本研究中，由于采用的rAd-p53试剂为不携带GFP的临床成品药物，因此首先采用rAd-GFP来初步确定POE-9n细胞对腺病毒转染的敏感性，同时通过MTT比色实验及免疫细胞化学染色实验来进一步确定rAd-p53对POE-9n细胞的转染效率，从3个不同的方面证实结果的可靠性。　　E1缺失的腺病毒载体虽然无复制能力，但剂量过大或转染时间过长时，腺病毒对感染细胞仍有一定的毒性。这限制了目的基因表达的时间和水平，以往人们发现，腺病毒的细胞毒性与MOI及感染时间呈明显的对应关系[7]，尤其是MOI达到500以上时，细胞毒性和由此带来的目的基因表达下降都有明显表现，但低于50时，腺病毒对细胞增殖没有明显影响[8-10]。在本研究中，rAd-GFP转染POE-9n细胞时在100～500的感染倍数（MOI）范围内可以获得比较稳定的转染效率，转染效率都大于95%。在进一步MTT实验中，在100～500的MOI范围内，POE-9n细胞的增殖抑制率也无明显差异。　　在此基础上，本研究最终选择了低滴度（MOI=100）的rAd-p53对POE-9n细胞进行转染。这是基于两个方面的考虑：一方面，MOI=100的rAd-p53已经对POE-9n细胞具有很好的敏感性，因此，为了尽量减少腺病毒转染的毒副作用，本实验选择了较低的转染滴度；另一方面，虽然有研究表明[11]，野生型P53蛋白半衰期短，较难用免疫细胞化学检测出来，而检测出的多为突变型P53蛋白，但本研究对MOI=100的rAd-p53转染后的POE-9n细胞内P53蛋白进行了免疫组化检测，发现几乎所有的细胞均有明显的胞核或细胞质阳性染色，同时在MTT实验中，rAd-p53转染后对POE-9n细胞的增殖有明显的抑制效果，由此说明MOI=100的rAd-p53已经能够有效地将外源性野生型p53基因导入POE-9n细胞，并发挥对异常增殖细胞的生长调控作用。【参考文献】　　[1] Reibel J. 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