唾液分泌型免疫球蛋白A对口腔白假丝酵母菌黏附的影响

    作者：陈昌荣，陈建钢    作者单位：1.赣南医学院第一附属医院口腔科 江西 南昌　341000；2.武汉大学中南医院口腔科 湖北 武汉 430071

    【摘要】  目的 从唾液分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的质量浓度和白假丝酵母菌黏附率变化的角度探讨人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者易感染口腔假丝酵母菌病的原因。方法 检测唾液sIgA的质量浓度，并通过体外黏附试验观察白假丝酵母菌标准株（SCAL）和临床分离株（CCAL）在含和不含sIgA环境中与颊上皮细胞的黏附率，比较HIV感染组与健康对照组口腔内白假丝酵母菌的黏附率。结果 HIV感染组sIgA的质量浓度低于健康对照组（P＜0.05）；在含sIgA环境中，SCAL和CCAL的黏附率总体均值低于不含sIgA环境中SCAL和CCAL的黏附率总体均值，两组间差异有统计学意义（P=0.001）；在含sIgA环境中，HIV感染组口腔中的白假丝酵母菌的黏附率明显高于健康对照组（P＜0.05）。结论 HIV感染组易感染口腔假丝酵母菌病与唾液sIgA的质量浓度变化和白假丝酵母菌黏附力改变密切相关。

    【关键词】  分泌型免疫球蛋白A； 白假丝酵母菌； 黏附； 人类免疫缺陷病毒； 获得性免疫缺陷综合征

    In vitro study of oral Saccharomyces albicans in adhesion from human immunodeficiency virus/acquired immunodeficiency syndrome individuals  CHEN Chang-rong1, CHEN Jian-gang2. （1. Dept. of Stomatology, TheFirst Affiliated Hospital of Gannan Medical School, Nanchang 341000, China; 2. Dept. of Stomatology, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan 430071, China）

    [Abstract]  Objective  To discuss the reason from which oral cavity Saccharomyces albicans get sick for beinginfected from the angle of looking at the human immunodeficiency virus（HIV）-infected persons and analyzingthe saliva secreted immunoglobulin A（sIgA） content and the Saccharomyces albicans adherency change rates.Methods  To exam saliva sIgA content, to observe the Saccharomyces albicans standard and clinical separation in content of sIgA that is not contained in the sIgA environment and the buccal mucosa epithelial cell adherency rate by the sticky experiment, and to compare the differences of oral cavity Saccharomyces albicans adherency rate between HIV/acquired immunodeficiency syndrome（AIDS） group and healthy control group. Results  ThesIgA content in HIV/AIDS group is lower than that of the healthy group（P＜0.05）. In the environment of sIgAcontent, the ensemble average of Saccharomyces albicans stick rate（standard and clinical separation） is lower than that of the non-sIgA environment, and therefore the differences between the two groups do have the statistics sig-nificance（P=0.001）. In the environment of sIgA content, Saccharomyces albicans adherency rate in the oral cavityof the HIV/AIDS group is higher than that of the healthy control group（P＜0.005）. Conclusion  The saliva sIgAcontent change and the Saccharomyces albicans adherency change in the HIV/AIDS group easily infected by the oral candidiasis are interdependent and their relationship is rather close.

    [Key words]  secreted immunoglobulin A； Saccharomyces albicans； adherency； human immunodeficiency virus； acquired immunodeficiency syndrome

    白假丝酵母菌（Saccharomyces albicans）曾称白色念珠菌，是人体正常菌群，主要寄生在人体的体表和口咽喉等部位，通常不致病，但在人体免疫系统受到抑制或损害时可引起严重的口腔白假丝酵母菌病。分泌型免疫球蛋白A（secreted im-munoglobulin A，sIgA）在防止白假丝酵母菌及其毒性产物通过黏膜进入机体等方面起着重要的作用。有学者对携带有口腔白假丝酵母菌的健康者的血清、唾液或排泄物中sIgA或白假丝酵母菌黏附等进行了大量的研究[1-2]，但是迄今未见对伴发口腔白假丝酵母菌感染的人类免疫缺陷病毒（hu-man immunodeficiency virus，HIV）感染者进行sIgA的质量浓度变化与白假丝酵母菌黏附率间关系的研究报道。为了了解唾液sIgA的质量浓度变化与白假丝酵母菌黏附率间的关系，本研究对10例HIV感染者和8例健康者的唾液sIgA的质量浓度及其在含和不含sIgA环境中的白假丝酵母菌标准株（SCAL）和白假丝酵母菌临床株（CCAL）的黏附率进行了检测，并探讨其作用和意义。

    1  材料和方法

    1.1  研究对象

    HIV感染组，10例均来自湖北省蕲春县疾病控制中心，经抗HIV抗体检测确诊阳性，其中经临床和真菌学检查诊断为口腔白假丝酵母菌病者1例，无症状口腔白假丝酵母菌带菌者3例，CD4+ T细胞数量（6～396）×106个/L。健康对照组，

    8例均来自武汉大学中南医院口腔科健康人群，其中经真菌学检查为健康无症状口腔白假丝酵母菌带菌者2例。所有受试者近1个月内均未使用过抗真菌药物、抗生素和免疫抑制剂等。

    1.2  标本采集

    采集所有受试者舌下混合唾液装于消毒瓶内，2 h内冰块冷冻下运到实验室，－70 ℃保存备用。用无菌棉拭子在宿主两颊部黏膜表面反复轻擦，将获取口腔分泌物的棉拭子置于消毒瓶中，2 h内冰块冷冻下运至实验室行直接镜检。

    1.3  标本检测

    1.3.1  唾液sIgA的质量浓度测定  sIgA的质量浓度测定采用放射免疫法。sIgA放射免疫分析试剂盒由上海放射免疫分析技术研究所提供，测定按说明书进行操作，结果用x±s表示，免疫计数器测定。

    1.3.2  直接镜检  用生理盐水作为口腔分泌物标本的载液，涂片加盖玻片，用微火加热后立即镜检，镜下见菌丝、假菌丝或芽生孢子就可确认真菌感染。

    1.4  黏附试验

    1.4.1  SCAL和CCAL的来源  SCAL由武汉大学医学院微生物教研室提供。CCAL来自获得性免疫缺陷综合征患者口腔分泌物的分离培养：将患者口腔分泌物标本接种于沙堡葡萄糖琼脂，35 ℃孵育24 h；再将可疑菌落转种于科玛嘉假丝酵母菌显色培养基，35 ℃孵育24 h；根据菌落的形态、颜色、凹陷程度初步判断为白假丝酵母菌，必要时用API20C准确鉴定。

    1.4.2  SCAL和CCAL悬液的制备  将SCAL和CCAL置于沙堡葡萄糖琼脂上37 ℃生长过夜，在分光光度计上用无菌的浓度为0.01 mol/L、pH7.2的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution，PBS）调配菌悬液至1×1010个/L细胞。

    1.4.3  颊上皮细胞（buccal epithelial cell，BEC）

    悬液的制备  试验当日无菌棉拭子擦拭健康者口腔两侧颊黏膜，将拭物用浓度为0.01 mol/L、pH7.2的PBS液1 500 g离心3 min，洗涤3次，调整BEC密度至1×109个/L细胞。

    1.4.4  制备含和不含sIgA的唾液上清液  将收集的所有受试者的唾液各取2 mL于4 ℃、4 800 g离心30 min，得唾液上清液。不含sIgA的唾液上清液加入兔抗人sIgA血清0.1 mL，于37 ℃、摇床180 r/min作用2 h，3 000 g离心3 min后取上清液。

    1.4.5  黏附试验  分别将含sIgA的唾液上清液0.1 mL（A组）和不含sIgA的唾液上清液0.2 mL（由0.1 mL唾液上清液和0.1 mL兔抗人sIgA血清组成，B组）与密度为1×1010个/L细胞的SCAL和

    CCAL于37 ℃、摇床180 r/min作用2 h，用无菌的浓度为0.01 mol/L、pH7.2的PBS于1 500 g离心3 min，洗涤3次，重悬至0.1 mL；再分别加入BEC悬液0.1 mL，于37 ℃、摇床180 r/min作用2 h，用无菌的浓度为0.01 mol/L、pH7.2的PBS于1 500 g离心3 min，洗涤3次弃去上清液；取沉淀物涂片，待干后用无水乙醇固定，革兰染色，镜下随机计数200个BEC中吸附3个白假丝酵母菌以上的BEC数，计算黏附率。

    1.5  统计学处理

    应用SPSS 11.5统计软件对计量资料进行统计分析。计量资料两组间比较用t检验，检验水平为α=0.05。

    2  结果

    2.1  唾液sIgA的质量浓度测定

    在健康对照组中，sIgA的质量浓度明显高于HIV感染组，差异有统计学意义（P＜0.05）。对HIV感染组和健康对照组口腔分泌物进行直接镜检，结果显示两组寄居菌百分率相近，差异无统计学意义（表1）。

    2.2  SCAL和CCAL与BEC黏附率测定在含sIgA的环境中，SCAL和CCAL黏附率总体均值低于不含sIgA环境中的SCAL和CCAL黏附率总体均值，两组间差异有统计学意义（P=0.001，表2）。

    HIV感染组在含sIgA和不含sIgA环境中SCAL和CCAL黏附率总体均值高于健康对照组，两组间差异有统计学意义（P<0.05，表3）。SCAL与CCAL在含sIgA和不含sIgA环境中的黏附率总体均值相接近，差异无统计学意义。

    在不含sIgA环境中，HIV感染组和健康对照组中的SCAL和CCAL的黏附力均值差异无统计学意义。

    2.3  sIgA的质量浓度与白假丝酵母菌黏附率的相关性

    sIgA的质量浓度，在HIV感染组低于健康对照组。在含sIgA环境中，HIV感染组的白假丝酵母菌黏附率高于健康对照组，两者呈负相关。

    3  讨论

    HIV感染者伴发口腔白假丝酵母菌感染被认为是全身和局部黏膜免疫功能减退[3]，而CD4+T细胞进行性缺失是HIV感染者全身免疫损害的主要原因。相关资料显示，在HIV感染组与健康对照组的CD4+ T细胞未出现变化前，白假丝酵母菌以寄居菌存在于口腔中，两组口腔寄居菌百分率相似，当CD4+ T细胞数降至300左右时，HIV感染者即可出现口腔白假丝酵母菌病；当降至200以下时，出现深部白假丝酵母菌感染[4]。黏膜免疫是降低或中止口腔白假丝酵母菌病发生和复发的有效途径，表现在阻止病原体入侵、诱导局部免疫反应和清除感染细胞，刺激全身或局部淋巴细胞免疫，抑制白假丝酵母菌吸附等方面。Lizeng等[5-6]认为，sIgA在第一时间与HIV发生高效中和作用对防治艾滋病及其机会性感染是很重要的。由此可见，唾液sIgA的质量浓度下降不仅不能阻抑白假丝酵母菌的黏附，反而是局部黏膜免疫受损的内在危险信号。Millon等[7-9]检测到的艾滋病患者唾液中的sIgA的质量浓度下降，与本试验HIV感染组的sIgA的质量浓度低于健康对照组的结果相符。众多学者还指出[10-11]，HIV/AIDS患者普遍存在口腔黏膜病毒感染和唾液腺疾病。故sIgA的质量浓度低的趋势一方面是免疫反应的过程中消耗，另一方面是唾液腺功能的减退。

    白假丝酵母菌致病的首要步骤是黏附、定植和侵袭[12-13]，故抑制白假丝酵母菌的黏附、侵袭是当前阻止白假丝酵母菌的策略之一。本研究与B?覿uerle等[14]的sIgA的质量浓度降低，HIV感染组较健康对照组更易出现白假丝酵母菌感染结果相一致。sIgA的质量浓度下降，白假丝酵母菌黏附率和毒性水平的增加，局部黏膜和整体免疫功能处于低滞状态致sIgA合成和分泌不足，可诱导白假丝酵母菌的过度生长[15]，从而不能阻抑或彻底限制白假丝酵母菌在口腔黏膜表面的生长繁殖。由此可以推测，sIgA的质量浓度降低和具有较强黏附的白假丝酵母菌在HIV感染者伴发口腔白假丝酵母菌病的发生发展中发挥了重要作用，也为其他毒力作用的发挥提供了良好的条件。

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