变异链球菌密度感应系统调控变链素的研究进展

    作者：王蔚璐综述 凌均 审校    作者单位：中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院牙体牙髓病科 广东 广州 510055

    【摘要】  密度感应是指细菌根据菌群密度的变化分泌和感应信号分子-感受态调节肽（CSP），调控相关基因的表达。变链素是变异链球菌合成分泌的抗菌性多肽，在菌群中可调节相关细菌的生物学行为。变异链球菌密度感应系统可调控变链素的合成和分泌，参与菌群间的交流，调控牙菌斑生物膜的稳定性。下面就近年来受密度感应系统调控的变链素的研究进展作一综述。

    【关键词】  变异链球菌； 密度感应； 变链素

    AResearch progress of mutacins regulated by quorum sensing in Streptococcus mutans  WANG Wei-lu, LING Jun-qi.  （Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Guanghua College of Stomatology, Sun Yat-Sen Uni-versity, Guangzhou 510055, China）

    [Abstract]  Quorum sensing is a process of cell-to-cell communication in Streptococcus mutans which secretes aspecial signal molecule-competence stimulating peptide（CSP）, then to induce and to activate the expression of related genes. Mutacin is antimicrobial substance produced by Streptococcus mutans, which coordinates biological behavior of related bacteria. However, quorum sensing can regulate mutacin to communicate with oral bacteria and regulate the stability of biofilm. This review summarized the reserch progress of mutacins regulated by quorum sensing in Streptococcus mutans in recent years.

    [Key words]  Streptococcus mutans； quorum sensing； mutacin

    细菌素是细菌在代谢过程中合成和分泌到周围菌群中的抗菌性多肽，是伴随核糖体合成机制产生的一类有抑菌活性的蛋白质，革兰阳性菌和革兰阴性菌均可产生细菌素。革兰阳性菌产生的细菌素依据翻译后修饰过程的不同分为2类[1]：一类是先由核糖体合成一个前体多肽，再经过一系列翻译后修饰形成的细菌素，因分子中含有羊毛硫氨酸的结构，被称为羊毛硫细菌素；另一类是翻译后不被修饰的细菌素，被称为非羊毛硫细菌素。细菌通过分泌细菌素对周围同种或异种细菌产生抑制，这种特性备受研究者关注。

    变异链球菌是导致人类龋病的主要病原微生物，所产生的细菌素称为变链素。根据其产生菌株的不同，可将变链素相应命名为变链素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ等。变链素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ属于羊毛硫细菌素家族，可对与其密切相关的菌种和周围其他革兰阳性细菌产生抑制作用；因此，变链素有望成为一种抗菌剂以杀死其他细菌，这一活性使变链素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ基因及其蛋白水平的研究广泛而深入。变链素Ⅳ属于非羊毛硫细菌素家族，其活性与变异链球菌密度感应系统密切相关，成为近年来研究的热点。

    1  变链素Ⅳ

    Qi等[2]在采用反相高压液相层析技术对Ⅰ型变异链球菌UA140产生的细菌素进行研究时发现了UA140的两个波峰，经过对这两个波峰的分析发现，UA140可产生两种细菌素：一种是羊毛硫细菌素——变链素Ⅰ，另一种是非羊毛硫细菌素，故将其命名为变链素Ⅳ。电子电离质谱分析发现，变链素Ⅳ属于非羊毛硫细菌素家族的二聚体细菌素，单体A的相对分子质量为4.169×103，单体B的相对分子质量为4.826×103。DNA和氨基酸序列分析发现，单体A由nlmA基因编码，由44个氨基酸组成；单体B由nlmB基因编码，由49个氨基酸组成。抗菌谱分析发现，变链素Ⅳ对口腔链球菌属大部分细菌有抑制活性的作用，但对放线菌属没有影响，这暗示变链素Ⅳ在菌间竞争中有重要作用。van der Ploeg[3]在采用lacZ报告基因检测nlmA、B基因表达的变化时发现，编码密度感应调控系统的comC、D、E基因突变时，nlmA、B基因表达明显下降，感受态刺激肽（competence stimulating peptide，CSP）可弥补comC突变体中nlmA、B基因的表达，但不能弥补comD、E突变体的表达；而CSP后期调控comX基因以及另外两个双组份信号调控系统编码基因ciaRH、vicRK突变对nlmA、B基因表达无明显影响。该研究结果提示，变链素Ⅳ是受comC、D、E基因密度感应系统调控产生的。

    变链素Ⅳ产生的量在对数生长晚期至稳定期早期达到最大，而浮游状态生长的变异链球菌产生的变链素Ⅳ的量较细胞平板培养时明显下降。变异链球菌在细胞内产生变链素Ⅳ后，由nlmT、E基因编码的转运蛋白与变链素Ⅳ结合并将其运送到细胞外发挥作用[4]。Kreth等[5]将变异链球菌野生株和nlmA、B基因突变株分别与携带穿梭质粒DNA的戈登链球菌共培养，以观察穿梭质粒DNA转化变异链球菌的转化率。结果显示，nlmA、B基因突变株的转化率低于野生株。将纯化的变链素Ⅳ加入到变异链球菌野生株和nlmA、B基因突变株内，实时定量PCR检测戈登链球菌释放游离DNA的质量浓度，结果变链素Ⅳ可以使戈登链球菌释放更多的游离DNA。

    Petersen等[6]采用绿色荧光染料检测菌斑生物膜中游离DNA的质量浓度，即在菌群中未加入CSP信号蛋白时，游离DNA的质量浓度达到了85 μg/L；在加入CSP信号蛋白后，游离DNA的质量浓度迅速增加至760 μg/L。该研究再次证明，变异链球菌通过密度感应系统调控菌斑生物膜中游离DNA的质量浓度来调控自身的生物学行为。

    2  变链素Ⅴ

    Hale等[7]在采用PCR连接诱变技术[8]诱变变链素相关编码基因研究变异链球菌UA159产生非羊毛硫细菌素的种类时发现，除nlmA、B基因编码的变链素Ⅳ外，还有一种新的非羊毛硫细菌素与变链素Ⅳ有相似的抑制指示菌株的作用，并可与变链素Ⅳ产生协同作用。该细菌素由SMU 1914c编码，随后将SMU 1914c命名为nlmC基因，该细菌素被称作变链素Ⅴ。

    Kreth等[9]发现，nlmC基因和一组类细菌素编码基因启动子区域大约有130 bp的序列与nlmA基因序列高度同源，尤其是变链素Ⅴ编码的基因启动子区域与nlmA基因有204 bp的同源序列；comE基因突变后，此类基因不表达，提示该同源序列可能为ComE调控因子的结合区域，变链素Ⅴ的产生同样受comC、D、E基因密度感应系统调控。Kreth等[10]进一步研究发现，nlmC基因启动区域有DRⅠ和DRⅡ两个11 bp的重复序列。电泳迁移率变动分析显示，纯化的ComE蛋白结合到这两个重复序列产生两个迁移条带，突变两个重复序列使ComE蛋白不产生迁移条带，从而证实了nlmC启动区域存在着ComE蛋白结合位点，而变异链球菌素调控机制由comD、E基因系统调控，不同于肺炎链球菌由comD、E基因和blpR、H基因这两个系统调控[11]。密度感应系统对变链素Ⅴ详尽的调控机制和变链素Ⅴ对牙菌斑生物膜的影响有待于继续深入的研究。

    3  变异链球菌素

    Longo等[12]发现，变异链球菌GS5合成的一种细菌素属于羊毛硫细菌素，但不属于变链素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ任何一个家族。Yonezawa等[13]对该细菌素进行了深入的研究后将其命名为变异链球菌素

    （S.mutans bacteriocin，Smb），并采用Tn916诱变技术和单特异性引物PCR对Smb进行鉴定。结果发现Smb是一种二聚体细菌素，由30个氨基酸的SmbA蛋白和32个氨基酸的SmbB蛋白组成。Smb的生物合成基因组包括smbM1、T、F、M2、G、A和B等7个基因，其中smbA、B为编码基因。RNA印迹技术分析显示，在变异链球菌comC基因突变体中，smbA和smbB基因表达明显下调；DNA序列分析显示，smbA基因上游启动区域有一段序列为CSP调控基因共有的com盒（TACGAATA）[14]，且smbM1基因上游区域竟与comC基因启动子区域有93%的同源性。这就预示着Smb同样受变异链球菌密度感应系统的调控，但具体的调控机制尚待进一步研究。

    4  其他变链素

    变链素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的生物学性质及其调控机制已基本明确，即受变异链球菌密度感应系统调控影响不大。近年来其他的研究者又相继分离和纯化出多种变链素，例如变链素K8和变链素N[15-16]。前者为一种羊毛硫细菌素，后者为一种类似于变链素Ⅳ单体B的非羊毛硫细菌素，其具体结构和特性尚未明确。

    5  结束语

    对于变异链球菌素的深入了解，将有助于进一步认识口腔微生物及其与口腔生态系的关系，有助于为阻断口腔菌群间的信号传递、降低口腔菌群的致病毒力和预防龋病的发生提供一种新的控制途径。

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