实验性糖尿病牙周炎诱导成骨细胞凋亡的研究

　　作者：付永伟 和红兵 欧炯光    作者单位：昆明医学院附属口腔医院 口腔内科，云南 昆明 650031

　　【摘要】 目的 观察糖尿病牙周炎条件下成骨细胞的凋亡情况。方法 选用SD大鼠62只，随机分为糖尿病牙周炎组（DP）、单纯牙周炎组（P）以及空白对照组（N）。采用一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法诱导大鼠糖尿病模型，采用丝线结扎联合口内接种细菌的方法建立牙周炎模型。各组动物分别于DP组、P组丝线结扎后第3、6周时分批处死，取标本进行组织学检测，并计算各组成骨细胞凋亡百分率。结果 丝线结扎后3、6周时，成骨细胞凋亡百分率由高至低依次为DP组、P组、N组，组间两两比较均有统计学意义（P＜0.05）。在丝线结扎后3周和6周时，DP组成骨细胞凋亡百分率均达到P组的2倍。结论 糖尿病可促进牙周炎条件下牙周组织中成骨细胞的凋亡。

　　【关键词】  牙周炎 糖尿病 成骨细胞 凋亡

　　Osteoblast apoptosis in experimental diabetic periodontitis in rats  FU Yong-wei, HE Hong-bing, OU Jiong-guang. （Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650031, China）

　　[Abstract]  Objective  To observe osteoblast apoptosis in diabetic periodontitis. Methods  Sixty-two SD rats were randomly divided into three groups： Diabetic periodontitis group（DP）, periodontitis group（P） and normal controlgroup（N）. Diabetes was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ）. Periodontitis was initiated byligating floss around maxillary second molars and inoculation of Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis）. Three orsix weeks later, the animals were sacrificed and the specimens were prepared for histological analysis. The percentageof apoptotic osteoblasts was examined. Statistical significance was determined by one-way ANOVA. Results  The se-quence of percentage of apoptotic osteoblasts among each group was group DP＞group P＞group N. Intergroup comparisons demonstrated that diabetic periodontitis and periodontitis might increase apoptosis of osteoblasts. The percentage of apoptotic osteoblasts in group DP was approximately two times higher than that in group P. Conclusion  The present study clearly demonstrates that diabetes can increase the apoptosis of osteoblasts in peri-odontitis.

　　[Key words]  periodontitis； diabetes； osteoblast； apoptosis

　　大量临床研究和流行病学调查显示，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者牙周炎发病率高，病变损害严重，且进展迅速。糖尿病牙周炎牙槽骨丧失明显增加[1-2]。骨丧失由骨重建失衡所致，骨重建由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成协同完成，当调控因素发生改变使得骨吸收大于骨形成时将导致骨丧失。大量研究提示细胞凋亡参与牙周炎的发生、发展过程[3]。此外，糖尿病的发病机制

　　及其某些并发症也与细胞凋亡紧密相关[4-6]。但对糖尿病条件下细菌及其代谢产物能否直接介导体内骨细胞凋亡仍缺乏系统的组织形态学研究。本实验通过建立大鼠糖尿病牙周炎模型，初步研究糖尿病牙周炎条件下成骨细胞的凋亡情况。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物及分组

　　选取由昆明医学院实验动物中心提供的清洁级雄性SD大鼠62只，6周龄，体重为180～220 g。将实验动物随机分为3组，分别为糖尿病牙周炎组（DP组，22只）、单纯牙周炎组（P组，20只）以及空白对照组（N组，20只）。

　　1.2  细菌培养和菌液制备

　　活化保存菌种牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）ATCC33277（由四川大学华西口腔医学院提供）接种于固体培养基中，在37 ℃厌氧条件下培养2～5 d，临用前挑取平板上活的单个菌落用无菌PBS配制成1×108 CFU/mL菌悬液5 mL，然后加入0.1 g羟甲基纤维素配制成含2%羟甲基纤维素的新鲜菌液，备用。

　　1.3  动物模型的建立

　　1.3.1  糖尿病模型的建立  DP组大鼠在适应性喂养1周后，禁食12 h，然后按55 mg/kg体重腹腔内一次性注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司，美国）。STZ临用前用柠檬酸钠缓冲液（0.05 mol/L，pH4.4）配成2%的溶液。P组注射等量柠檬酸钠缓冲液。N组不予处理。注射后1周检测血糖，血糖大于等于16.65 mmol/L者定为糖尿病大鼠，进入实验，此后每周采尾血检测空腹血糖1次，直至实验结束。

　　1.3.2  牙周炎模型的建立  DP组大鼠在糖尿病模型建立后1周，和P组大鼠一起在3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下，用5-0号医用丝线在大鼠左侧上颌第二磨牙环牙颈部结扎，颊侧打结。从结扎当天开始隔日接种P.gingivalis，用制备好的菌液在每只大鼠口内种菌0.1 mL，共3次。N组大鼠不予处理。

　　1.4  标本采集

    　N组和DP、P组动物一起于DP、P组牙颈部结扎后第3、6周时，采用断颈法分批处死，每组每批10只。处死后迅速分离大鼠上颌骨，在上颌中线处将其一分为二。将左侧上颌骨置于0～4 ℃条件下4%多聚甲醛固定液中固定24 h，15%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）脱钙液脱钙3～4周。系列乙醇脱水，二甲苯置换至石蜡包埋。近远中向连续5 μm厚石蜡切片，行组织学检测。

　　1.5  组织学检测

　　1.5.1  苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色

　　切片常规HE染色，取相邻牙齿冠根系统完整的切片，在光镜下观察第一、二磨牙间和第二、三磨牙间的牙周组织病理改变。

　　1.5.2  原位细胞凋亡检测  按照原位细胞凋亡检测试剂盒（R&D公司，美国）的操作步骤进行操作：切片常规脱蜡至水，PBS洗10 min，蛋白酶K消化15 min；蒸馏水洗2次，每次2 min，3%过氧化氢甲醇孵育5 min；PBS洗1 min，滴加TdT标记液于37 ℃湿盒内孵育1 h，TdT终止液体孵育5 min；PBS洗2次，每次2 min，Streptavidin-HRP室温孵育10 min；PBS洗2次，每次2 min，DAB显色10 min；蒸馏水洗数秒种，1%甲基绿复染3 min，蒸馏水洗数秒种，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。选取相邻牙齿冠根系统完整的切片，观察第一、二磨牙间和第二、三磨牙间成骨细胞的凋亡情况。在400倍视野下对该区域连续拍照，应用Mias图像分析系统3.0计数凋亡阳性成骨细胞。同时在HE染色切片上计数该区域成骨细胞总数。最后，计算该区域成骨细胞的凋亡百分率。

　　1.6  统计学分析

　　 应用SPSS 13.0统计软件包分析处理实验数据，采用单因素方差分析和q检验比较3组成骨细胞凋亡百分率之间的差异。首先对各组数据进行正态性检验和方差齐性检验，若数据符合正态分布和方差齐性则通过ANOVA对3组相应指标的均数进行显著性检验，并通过q检验进行样本均数的两两比较。如果方差不齐，则采用秩和检验。

　　2  结果

　　2.1  血糖变化

　　注射STZ前，各组大鼠血糖间差异无统计学意义。注射STZ后1周，2只DP组大鼠血糖低于16.65 mmol/L，被剔除，其余DP组大鼠血糖均超过16.65 mmol/L，达到糖尿病模型标准。

　　2.2  组织学观察

　　栓线后3、6周N组、DP组、P组牙周组织形态学观察结果见图1。栓线后3周时，N组牙龈乳头正常，上皮附着位于釉牙骨质界处，牙周膜纤维排列整齐，牙槽嵴顶高度正常；P组牙龈乳头丧失，牙周组织胶原纤维束排列紊乱，有炎症细胞浸润，牙槽嵴顶轻度吸收；DP组牙龈乳头丧失，上皮钉突增生，上皮及固有层下方见大量炎症细胞浸润，大部分胶原纤维溶解丧失，牙槽骨重度吸收。栓线后6周时，N组牙龈乳头基本正常，上皮附着位于釉牙骨质界处，牙周膜纤维排列整齐，牙槽嵴顶高度正常；P组牙龈乳头丧失，牙周组织胶原纤维束排列紊乱，大量炎症细胞浸润，牙槽嵴顶中度吸收；DP组牙龈乳头丧失，上皮钉突增生成条索状或网眼状，大部分胶原纤维溶解丧失，被炎症细胞取代，牙槽骨重度吸收。

    2.3  原位细胞凋亡检测结果

    2.3.1  凋亡成骨细胞观察结果  镜下观察，凋亡阳性成骨细胞位于骨组织表面，与成纤维细胞相似，呈梭形，胞核染色棕黄色，但活跃的成骨细胞呈立方形，细胞核呈圆形（图2）。观察第一、二磨牙间和第二、三磨牙间（釉牙骨质界到根尖区）的凋亡成骨细胞：DP组、P组大鼠栓线后3、6周，N组每张切片偶尔可见1个凋亡成骨细胞，有的观察不到；P组每张切片一般有2～3个凋亡阳性成骨细胞；DP组凋亡阳性成骨细胞数目较多，每张切片可达5～8个。

    2.3.2  凋亡成骨细胞凋亡计数  成骨细胞的凋亡情况见图3。DP组、P组大鼠栓线后3周时，各组间成骨细胞凋亡百分率相比差异有统计学意义（P＜0.05），且由高到低分别为DP组、P组、N组；栓线后6周时，N组凋亡百分率无明显变化，P组和DP组凋亡百分率进一步增高，其中以DP组增高更加明显，3组间成骨细胞凋亡百分率相比差异有统计学意义（P＜0.05），且由高到低分别为DP组、P组、N组。在丝线结扎后3、6周，DP组成骨细胞凋亡百分率达到P组的2倍。

    3  讨论

    对糖尿病加重牙周组织破坏的内在机制进行大量研究后认为糖尿病可能通过延长炎症反应的时间来改变细菌与宿主之间的相互作用，加重牙周组织破坏。并认为糖尿病可能通过增加肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等炎症介质的表达加强基质生成细胞的凋亡，从而影响组织愈合[7-9]。

    本实验观察了糖尿病大鼠在局部刺激因素下的牙周组织改变。组织学观察结果均显示：与非糖尿病牙周炎大鼠相比，糖尿病牙周炎大鼠牙周组织破坏进展速度快，破坏程度更加严重。因而进一步证实了合并有糖尿病时，在局部因素作用下牙周组织破坏进展快，程度严重。

    成骨细胞是参与骨改建的主要细胞之一。成骨细胞最终有3种转归：一部分被埋于其自身分泌的骨基质中转换为骨细胞；一部分转变为静止的骨衬细胞；其余的则以凋亡的形式死亡。本实验中观察到P组和DP组成骨细胞凋亡百分率明显高于N组，其中DP组成骨细胞凋亡百分率又高于P组。该结果提示：成骨细胞凋亡参与了牙周炎骨丧失，成骨细胞凋亡增加可能导致骨吸收之后骨形成不足；而糖尿病可能通过增强炎症部位成骨细胞凋亡，使骨吸收-形成偶联失衡，加重牙周炎骨丧失。He等[10]也认为糖尿病对新骨形成的抑制作用与其对成骨细胞的促凋亡作用相一致。

    目前糖尿病加强细胞凋亡的机制尚未明确，其可能机制包括：1）糖尿病条件下，细菌引起的炎症反应持续时间延长[11]。炎性细胞持续浸润以及高血糖状态下晚期糖化终末产物的间接作用导致白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、TNF等细胞因子生成增加[12]。而TNF水平增高可放大由caspase-3途径引起的细胞凋亡作用。2）糖尿病增加细胞凋亡的另一机制是活性氧的产生。长期的炎症及高血糖状态会引起细胞内活性氧积聚。现已证实氧化应激（oxidative stress，OS）可诱发多种细胞的凋亡[13]。而且，活性氧能够启动线粒体细胞色素C释放并激活caspase-3途径，诱导细胞凋亡[14-16]。糖尿病可加重牙周炎牙周组织破坏。糖尿病条件下牙周炎牙周组织中成骨细胞凋亡增加。这样，糖尿病可能通过加剧牙周炎条件下牙周组织中成骨细胞的凋亡，降低成骨细胞数量，从而使骨吸收-形成偶联失衡，进一步促进牙周炎骨丧失。

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