PCNA、p53和hTERT在口腔黏膜癌前病变和鳞癌中的表达及意义

作者：吴国英　朱玲　冯振卿　彭韬

　　［摘要］  目的：探讨PCNA、p53蛋白和hTERT在口腔黏膜癌前病变和鳞癌组织中的表达及临床意义。方法：采用原位杂交和免疫组化技术检测口腔黏膜单纯增生(HP)9例，轻度异常增生(LD)11例，中度异常增生(MD)10例，重度异常增生(原位癌CIS)9例，鳞癌(SCC)11例中p53蛋白、PCNA和hTERTmRNA的表达。结果：PCNA、p53和hTERT在口腔黏膜癌前病变和鳞癌中均有表达的异常。结论：hTERT、PCNA和p53与口腔黏膜癌前病变癌变的发生发展有关，它们的异常表达有助于口腔黏膜癌前病变和鳞癌的早期诊断，为研究癌前病变癌变的发生提供了一定的理论依据。

　　［关键词］  癌前病变  鳞癌  端粒酶逆转录酶  增殖细胞核抗原  p53

　　Expressions of PCNA、p53 and hTERT in Pre-malignant Lesions of Oral Mucosa and Oral Squamous Cell Carcinomas and their Clinical Significance.

　　WU Guo-ying, ZHU Ling，FENG Zhen-qing, et al.

　　The Stomatology School of Nanjing Medical University, Nanjing 210029

　　［Abstract］Objective: To investigate the expressions of human telomerase reverse transcriptase(hTERT)、p53 and proliferation cell nuclear antigen(PCNA) in pre-malignant lesions of oral mucosa and oral squamous cell carcinomas and their clinical significance. Methods: The expression of hTERT、p53and PCNA were detected by in situ hybridization and immunohistochemical technique in 9 cases of oral mucosal hyperplasia(HP), 11 cases of light dysplasia(LD), 10 cases of medium dysplasia(MD), 9 cases of carcinomas in situ(CIS) and 11 cases of squamous cell carcinomas(SCC). Results: HTERT、p53 and PCNA were abnormally expressed in  pre-malignant lesions of oral mucosa and oral squamous cell carcinomas. Conclusion: The examination of hTERT、p53 and PCNA expressions can help early diagnosis, and provide some theoretical evidence for the process of malignant change of oral mucosal precancerous lesions.

　　［Key words］  Precancerous lesion  Squamous cell carcinoma  Human telomerase reverse transcriptase  Proliferation cell nuclear antigen  p53

    口腔鳞癌是口腔肿瘤中最常见的恶性肿瘤，而口腔鳞癌中约9%～19%由口腔黏膜癌前病变发展而来，其发生发展受诸多因素的影响。端粒酶是合成及维持端粒重复序列的一种特殊核糖核酸蛋白质复合体，主要由3部分组成：人端粒酶mRNA(hTR)、端粒酶相关蛋白(TP1)和人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase ,hTERT),其中hTERT是维持端粒酶活性最重要的成分，与端粒酶活性呈平行相关［1,2］，而端粒酶活性是癌细胞无限增殖的基础。增殖细胞核抗原(proliferation cellnuclear antigen ,PCNA)已被证实与细胞增殖、病变活跃和恶性程度密切相关。抑癌基因p53结构和功能的异常与大多数恶性肿瘤的发生密切相关。本研究应用原位杂交及免疫组化方法检测了癌前病变、鳞癌中的hTERT、PCNA和p53蛋白的表达，以揭示端粒酶活性、p53蛋白和PCNA在口腔黏膜癌前病变癌变发生发展中的作用，不仅有助于阐明口腔黏膜癌前病变癌变发生发展的机制，且有利于临床筛选高危人群和评估癌的预后及治疗效果。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本来源  收集南京医科大学口腔医学院黏膜科及外科2002~2003年活检或手术患者病变组织块，10%甲醛液固定，常规石蜡包埋，部分标本选自病检存档蜡块，共50例，其中单纯增生(hyperplasia,HP)9例，轻度异常增生(light dysplasia,LD)11例，中度异常增生(medium dysplasia,MD)10例，重度异常增生(原位癌 carcinomas in situ ,CIS)9例，鳞癌(squamous cell carcinomas ,SCC)11例。据WHO(1997)口腔癌和癌前病变研究中心的组织学诊断标准：镜检如发现有不同程度的上皮异常增生，即可诊断为癌前病变，即本研究的病例中癌前病变为30例(LD11例，MD10例，CIS９例)，经统计学处理，各组病例的平均年龄和男女比例无显著性差异。

1.2  试剂与方法  原位杂交：探针、试剂盒购自北京大学医学部病理系，包括：PK（蛋白酶K）（1∶10），Hyb A液，Hyb B 液（即地高辛标记cRNA探针），马血清（1∶100），BCIP（1∶100），Anti-Dig-AP（1∶500），NBT（1∶100）。按说明书进行，以试剂盒提供的已知hTERTmRNA阳性的口腔鳞癌标本为阳性对照，用PBS液代替探针杂交液作阴性对照。免疫组化：Ⅰ抗：PCNA鼠抗IgG（PC 10），p53鼠抗IgG（DO-7），购自北京中山生物技术有限公司；Envision二步法试剂盒购自DAKO公司。按说明书进行，以已知PCNA或p53阳性的乳腺癌组织为阳性对照，用PBS液代替一抗作阴性对照。

　　1.3  结果判定  PCNA、p53阳性细胞为细胞核呈棕黄色颗粒，随机选5个视野低倍镜（×200）采用图像分析系统对PCNA、p53阳性细胞进行计数，将收集的数据进行整理，并由此得出阳性细胞的百分比。hTERT阳性为细胞浆中出现蓝紫色颗粒,根据口腔黏膜上皮细胞特点及探针的定位特异性，并参考钟鸣［3］等文献资料，将染色结果分为：＜10%计（-）即阴性，10%~40%计（+）即弱阳性，40%~70%计（++）即中阳性，≥70%计（+++）即强阳性。

　　1.4  统计学分析  检测结果用SPSS 11.00软件进行统计学分析，各组的PCNA、p53 阳性细胞百分比进行单因素方差分析， hTERT阳性率进行X2检验。

　　2  结果

　　2.1  hTERT的表达  hTERT在单纯增生组中仅1例有弱表达，主要位于基底层及棘细胞深层。在上皮异常增生组中，随着异常增生程度的增加，hTERT阳性率也逐渐增加，鳞癌时hTERT阳性率达最高，见表1。且随着异常增生程度的增加阳性细胞分布也从基底层向表层扩展，在重度异常增生或原位癌中，甚至可达上皮全层，在高分化鳞癌中，阳性细胞主要分布在癌巢周边部，分化较差的鳞癌，肿瘤细胞呈片状弥漫性阳性染色。

　　2.2  p53蛋白的表达  p53蛋白在单纯增生组中仅1例有弱表达，主要位于基底细胞层。在上皮异常增生组中，随着异常增生程度的增加，p53蛋白阳性率增加， 阳性细胞百分比也相应增加，鳞癌时达最高，见表2。随着异常增生细胞从基底层向角化层不断发展，阳性细胞也从基底层向角化层发展。在高分化鳞癌中，阳性细胞多位于癌巢周边，分化差的鳞癌中则弥散分布。

　　表1  hTERT在口腔黏膜癌前病变和鳞癌中的表达　略

　　表2  p53蛋白与PCNA在口腔黏膜癌前病变和鳞癌中的表达　略

　　2.3  PCNA的表达  在单纯增生组中阳性细胞较少，散在分布于基底细胞层。在上皮异常增生组中，随着病变程度的加重，PCNA阳性率增加，阳性细胞百分比也增加，鳞癌时阳性细胞百分比达峰值，见表2。LD阳性细胞主要集中于基底层，沿过度增长的上皮钉突呈连续性分布，MD阳性细胞数进一步增加，且出现于基底层以上部位，CIS阳性细胞更为密集并扩展到上皮全层，呈弥漫性分布。高分化鳞癌中，PCNA阳性细胞主要沿癌巢周边分布，角化珠阴性，分化差的肿瘤中则弥散分布且较密集。在单纯增生组7例PCNA阳性标本中，仅1例为hTERT阳性，其余6例hTERT阴性，但有1例p53阳性；在轻度异常增生组10例PCNA阳性标本中，仅2例为hTERT阳性，其余8例为hTERT阴性，但有1例p53阳性；在中度异常增生组10例PCNA阳性标本中，5例为hTERT阳性，1例p53阳性，而在5例hTERT阴性标本中有3例p53阳性；在9例重度异常增生组中，3例为PCNA、hTERT 、p53阳性共表达，在4例hTERT阴性而PCNA阳性标本中，3例为p53阳性；在11例鳞癌组中，6例为PCNA、hTERT 、p53阳性共表达，在2例hTERT阴性而PCNA阳性标本中，p53阳性均为阳性。

　　3  讨论

    端粒-端粒酶机制是近年肿瘤研究的热点，端粒酶通过催化端粒合成，保持端粒长度而维持细胞持续分裂能力，其激活与细胞增殖和永生化密切相关，端粒酶活性由其重要组分hTERT决定［1］，45%~81.18%的口腔黏膜上皮异常增生和鳞癌中可测到端粒酶活性［4］。口腔鳞癌的发生与上皮异常增生关系密切，且异常增生程度与癌变呈正比，这种从异常增生到癌的连续性谱系为研究口腔鳞癌的发生的分子机制提供了良好模式，对异常增生到癌的连续病变如口腔鳞癌、胃癌等的研究均显示端粒酶活性逐渐递增［4，5］。本研究显示hTERT的表达在口腔黏膜轻度、中度、重度异常增生至鳞癌中呈递增表现，且鳞癌中显著高于异常增生，提示hTERT阳性的上皮异常增生，癌变危险性增加。p53基因是至今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，现普遍认为p53是抑癌基因，只有p53发生基因突变或与其他蛋白相互作用，才导致p53正常功能丧失，进而引起肿瘤形成。约12%~100%的口腔鳞癌和头颈部鳞癌中存在p53突变［6］，主要存在于上皮基底层和肿瘤前沿。本研究显示口腔鳞癌组织中p53蛋白有72.73%的阳性，在上皮异常增生占35.38%，两者差异显著(P<0.05)，提示p53的突变在肿瘤的发生发展中意义重大，可通过检测p53突变/表达来预测个体对癌症危险性的反应。

    PCNA是DNA聚合酶的辅助蛋白，也是一种细胞调节蛋白，随细胞周期而变化，是评价细胞增殖状态的客观指标，目前已广泛应用于癌前病变、恶性肿瘤细胞增生活性的研究。本研究显示在分化好的肿瘤，特别是角化明显的鳞癌，阳性细胞主要分布在癌巢周围，在分化差的肿瘤，PCNA阳性细胞较密集。

    本研究还发现在重度异常增生中有3例PCNA、p53蛋白及hTERT的共表达，在鳞癌中有6例共表达。经临床1~2年的随访观察，3例重度异常增生中有2例手术后复发，1例失访，6例鳞癌中有3例手术后复发，1例失访，2例还在随访中。

    肿瘤的发生发展是一个多步骤的过程，往往是在致病因素作用，多种基因同时或先后协同作用的结果。hTERT、p53、PCNA均参与口腔黏膜癌前病变癌变的发生发展，其在上皮重度异常增生及鳞癌中的高表达及上皮单纯增生中的低表达，表明hTERT、p53、PCNA有望成为肿瘤标志物，临床上多种基因的同时检测，将有利于监控鳞癌的发生和发展，以及预后的评估。

　　参考文献

　　［1］  Sumida T, Hamaka H, Sogawa K, et al. Telomerase components as a diagnostic tool in human oral lesions ［J］. Int J Cancer, 1999,80(1)∶1-4

　　［2］  Takakura M, Kyo S, Kanaya　T, et al. Expression of　 human  telomerase  subunits and correlation with telomerase activity in cervical cancer ［J］. Cancer Res, 1998,58(7)∶1 558-1 561

　　［3］  钟鸣，王洁，韩有平，等.端粒酶逆转录酶基因在牙源性病损中的表达［J］.中华口腔医学杂志,2002,37(4)∶257-259

　　［4］  吴国英，朱玲，祁兵.端粒酶逆转录酶在口腔黏膜癌前病变和鳞癌中的表达［J］.口腔医学，2003,23(3)∶137-139

　　［5］  杨仕明，张学庸，樊代明，等.胃癌和癌前组织中端粒酶活性的检测及其临床意义［J］.中华医学杂志，1998,78∶207-209

　　［6］  Nagai MA, Miracca EC, Yamamoto L, et al. Tp53 genetic alterations in head and carcinomas from brazil ［J］. Int J Cancer,1998,76(1)∶13-18

　　基金项目  江苏省教育厅自然科学研究基金资助项目（编号：03KJD320148）

　　作者简介  吴国英（1964~ ），女，江苏人，副主任医师，副教授，硕士，主要从事口腔黏膜及牙体牙髓病的临床工作。