人基因重组骨形成蛋白-2对牙周韧带细胞群成纤维表型的影响

　　作者：谢成婕 王贻宁

　　【关键词】  人基因重组骨形成蛋白-2

　　［摘要］  目的：探讨人基因重组骨形成蛋白-2(rhBMP-2)对牙周韧带细胞群（PDLC）成纤维表型的影响。方法：PDLC在含不同浓度的rhBMP-2的培养液中培养，采用免疫细胞化学技术做表皮生长因子受体（EGFR）的检测，并用图像分析软件分析EGFR表达的强弱。结果：rhBMP-2作用下，PDLC的EGFR的表达有变化（P<0.05），25~100 μg/L组EGFR的表达减弱，100 μg/L组最弱，随rhBMP-2浓度上升，EGFR的表达又有增强的趋势。结论：rhBMP-2对PDLC的成纤维表型产生了影响，合理剂量的rhBMP-2应用可以保证PDLC成纤维表型的较高表达，使种植体周牙周韧带的构建成为可能。

　　［关键词］  人基因重组骨形成蛋白-2  牙周韧带细胞群  成纤维表型  表皮生长因子受体

　　Effects of Recombinant Bone Morphogenetic Protein-2 on Fibroblastic Phenotype of Periodontal Ligament Cells Population.

　　XIE Cheng-jie, WANG Yi-ning.

　　School of Stomatology, Wuhan University, Wuhan 430079

　　［Abstract］Objective: To explore the effects of rhBMP-2 on the fibroblastic phenotype of PDLC. Methods: PDLC were incubated under different concentration of rhBMP-2, the expression of EGFR was detected by immunocytochemistry technique, and then analyzed with HMIAS-1000 color image system. Results: rhBMP-2 had an effect on the expression of EGFR（P<0.05）, which decreased in the range of 25μg/l~100μg/l rhBMP-2 and had the lowest expression at 100μg/l rhBMP-2, but up-regulated as the concentration of rhBMP-2 increased. Conclusions: rhBMP-2 has an effect on the fibroblastic phenotype of PDLC, and the appropriate dose of rhBMP-2 can assure the stability of the fibroblastic phenotype , which makes it possible to construct periodontal ligament around dental implant.

　　［Key words］  rhBMP-2  PDLC population  Fibroblastic phenotype  EGFR

    牙周韧带细胞群（periodontal ligament cells population,PDLC）是具有异质性的细胞群，可粗略的分为成骨表型和成纤维表型，这是将PDLC作为种子细胞构建组织工程化种植牙牙周膜的理论基础。大量文献证明人基因重组骨形成蛋白(recombinant bone morphogenetic protein,rhBMP-2)可以提高PDLC的碱性磷酸酶(ALP)活性,使其成骨表型增强，可望利用rhBMP-2促进种植牙牙周韧带结构形成。但是在rhBMP-2的作用下，PDLC的成纤维表型如何变化，rhBMP-2是否会使PDLC的成纤维表型完全丧失而导致种植牙牙周韧带结构失败？本实验拟探讨rhBMP-2对PDLC成纤维表型的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料和器械  高糖最低必须培养基（Gibco,美国），胰蛋白酶（sigma,美国），胎牛血清(Gibco,美国)，rhBMP-2(第四军医大学生化教研室)，表皮生长因子受体鼠抗人单克隆抗体，SP试剂盒，DAB试剂盒（北京中杉生物技术公司），超净工作台（苏州净安泰空气技术有限公司），二氧化碳孵箱（Heraeus,德国），倒置相差显微镜及照相系统（Nicon,日本）。

　　1.2  实验分组  1）对照组：PDLC用含20 mL/L血清的培养液培养。2）实验组：PDLC用含20 mL/L血清和浓度分别为400 μg/L，200 μg/L，100 μg/L，50 μg/L，25 μg/L rhBMP-2的培养液培养。

　　1.3  PDLC的培养与鉴定  取因正畸需要拔除的健康前磨牙，用刀片刮取根中1/3牙周膜组织，剪成1 mm ×1 mm ×1 mm小块，均匀铺于培养瓶底，用含20 mL/L血清培养液在标准环境下培养，待细胞长至80%汇合点时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，波形蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性证明其来源于外胚间充质,可用于进一步实验。

　　1.4  制备细胞爬片  取第3代细胞，按1×104个/mL接种于铺有盖玻片的培养瓶中，48 h后待细胞贴壁并伸展至正常形态后，按实验分组加入培养液，标准环境下孵育5 d，PBS冲洗，冷丙酮固定10 min，晾干，-20 ℃ 储存。

　　1.5  EFGR免疫染色  固定的爬片经0.5%Triton X-100,3%H2O2处理,PBS清洗后, 滴加正常山羊血清37 ℃温育30 m in, 弃去血清后滴加鼠抗人EGFR单抗,4 ℃过夜；滴加生物素化的山羊抗鼠IgG,37 ℃温育30 min，然后滴加S -A/HRP复合物37 ℃温育30 min, 各步之间均以PBS充分振洗；最后滴加新鲜配制的DAB显色液,室温下7 min,蒸馏水冲洗终止反应,苏木精复染,逐级酒精脱水后二甲苯透明,中性树胶封片。以正常山羊血清替代一抗作为阴性对照。

　　1.6  图像分析和统计  采用HMIAS-1000型全自动医学彩色图像分析系统对染色结果进行分析，每张盖玻璃片上随机选取5个视野，计算平均光密度值，采用统计学软件SPSS 11.0进行单因素方差分析和组间比较。

　　2  结果

　　2.1  细胞生长状态观察  第5天有细胞从组织块周围爬出，约15天左右细胞汇合可以传代。原代细胞围绕组织块生长，兼有少量不规则细胞，以短梭形为主，胞核较大呈椭圆形；传代后细胞生长成旋涡状，大小形态趋于一致，成长梭形，有较长细胞突，胞浆丰富，胞核清晰可见。

　　2.2  爬片结果观察  镜下可见同一处理液同一培养瓶中各盖玻片上细胞数目不尽相同，盖玻片上以周边细胞生长旺盛，形态较好；rhBMP-2作用下细胞突变少，固定后细胞形态略有变形，但清晰可见细胞核，细胞浆和少量细胞突起。

　　2.3  染色结果  400 μg/L组可见胞浆中有大量棕黄色颗粒，尤以核膜周围着色最深，见图1；100 μg/L组染色最浅，胞浆几乎不着色，隐约可见淡黄色，相比下胞核的浅紫色较明显，见图2；对照组细胞数目较少，但细胞着色很深，呈明亮的黄色，见图3。

　　图1 － 图3  略

　　2.4  图象分析统计结果见表1。

　　表1  不同浓度rhBMP-2作用下EGFR表达强度　略

　　3  讨论

    rhBMP-2是目前已知的能单独促进干细胞向成骨方向分化的生长因子，在其作用下，多能干细胞的成骨表型上调，ALP等成骨表型的标记物表达增加，对于PDLC这种异质性细胞，rhBMP-2也有同样的作用［1］，有些学者已经在尝试将rhBMP-2应用于牙周组织再建，用以促进新骨的生长［2］。但是牙周组织是一个由软硬组织组成的混合体，再建的牙周组织不应全部是骨或者全部是软组织，将牙周组织再生等同于牙槽骨再生是武断的，因此有必要探讨rhBMP-2作用下PDLC的成纤维表型的变化。

    可以作为PDLC表型的标记有很多［3］，而Lin［4］在分析PDLC群的异质性时认为PDLC群细胞可以分为两大类，一类是具有成骨表型的细胞，以ALP，OPN等为标记；一类是具有成纤维表型的细胞，以表达EGFR，Ⅻ胶原等为特征。少数学者认为正常的牙周组织和体外培养的PDLC都不表达EGFR［5］，但多数学者认为EGFR有维持PDLC成纤维表型的功能，EGFR的变化反应了PDLC成纤维表型的变化［6］。

　　图4  不同浓度rhBMP2作用下EGFR表达变化趋势　略

    本实验中，实验组与对照组有统计学差异，说明rhBMP-2对PDLC的成纤维表型有影响，但EGFR的变化趋势和rhBMP-2的浓度变化并不是直线依赖性的。在0~100 μg/L的范围内，EGFR的变化趋势和rhBMP-2浓度是负相关的，当rhBMP-2浓度为100 μg/L时，EGFR的表达最弱，当rhBMP-2继续升高EGFR的表达又有回升的趋势，本实验可以看出rhBMP-2在100~400 μg/L范围内EGFR的表达是上升的，见图4。由EGFR表达的变化趋势可以推测PDLC自身可能存在着某种调节机制使其在rhBMP-2浓度升高的情况下保持其成纤维表型，而这种机制可能就是由EGFR介导的信号传导通路。

    对实验数据的进一步分析还可以看出，在0~50 μg/L的范围内，EGFR表达强度下降的很快，而100~400 μg/L范围更大，变化的幅度却小一些，推测小剂量的rhBMP-2即可对PDLC的成纤维表型发生显著影响。

    PDLC成纤维表型是多年研究的热点，牙周膜能在牙槽骨和牙骨质这两种矿化组织间始终保持一定的宽度而不矿化，提示一定存在某种机制使成纤维表型和成骨表型达到了动态平衡。马良，刘宏伟等［7，8］的研究发现在无任何矿化因子的诱导下，PDLC群内具有钙化能力的细胞占可以增殖细胞总数的38%，Matsuda N等［6］也发现在矿化液的促进下成骨标志ALP的表达增加，而EGFR的表达下降，这些研究说明PDLC群内成纤维表型细胞和成骨表型细胞是成比例的，且成纤维表型是PDLC群的优势细胞表型。通过矿化因素的介入，可以使PDLC群的优势表型下降，从而产生成纤维表型和成骨表型的平衡。本实验的结果也证实了这一点，提示应用rhBMP-2促进牙周骨再生时应把握好剂量，这样不仅促进PDLC向成骨方向的分化，同时也使其成纤维表型保持在较高的水平，从而为种植体周形成牙周韧带样结构而达到生物整合提供可能。

　　参考文献

　　［1］  司晓辉，刘正.重组人骨形成蛋白2 对人牙周膜成纤维细胞的生物学作用［J］.华西口腔医学杂志，2002 ，20 （1 ）∶10-13

　　［2］  吴昊，谢昊，李成章.自固化磷酸钙与BMP复合植入修复牙周骨缺损的实验研究［J］.口腔医学研究，2004，20（1）∶36-38

　　［3］  峰煜，周彬.牙周韧带细胞的表型分化及其表面标记物［J］.国外医学口腔医学分册,2003，30（4）∶280-282

　　［4］  Lin DG, Kenny DJ, Barrett EJ, et al. Storage conditions of avulsed teeth affect the phenotype of cultured human periodontal ligament cells ［J］. J Periodont Res, 2000, 35∶42-50

　　［5］  Parkar MH, Kuru L, Giouzeli M, et al. Expression of growth-factor receptors in normal and regenerating human periodontal cells ［J］. Arch Oral Biol, 2001, 46(3)∶275-284

　　［6］  Matsuda N, Kumar NM, Ramakrishnan PR, et al. Evidence for up-regulation of epidermal growth-factor receptors on rat periodontal ligament fibroblastic cells associated with stabilization of phenotype in vitro ［J］. Arch Oral Biol, 1993, 38(7)∶559-569

　　［7］  马良，刘宏伟，欧龙，等.人牙周膜细胞不同生物学特性的表达［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9 （3）∶191-194

　　［8］  Liu HW,Yacobi R,Savion N, et al. A Collagenous Cementum-Derived Attachment Protein Is a Marker for Progenitors of the Mineralized Tissue-Forming Cell Lineage of the Periodontal Ligament ［J］. J Bone Miner Res,1997,12(10)∶1 691-1 699