转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形成蛋白2（BMP2）体外联合诱导成牙本质细胞样细胞分化

　　作者：朱奇 樊明文　张旗 陈智 边专

　　【关键词】  转化生长因子β1

　　［摘要］  目的：观察转化生长因子β1（transforming growth factor β1, TGF-β1）和骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）联合应用对体外培养的鼠牙乳头成牙本质细胞分化的影响。方法：取17 d胎龄小鼠下颌第一磨牙牙胚，胰蛋白酶消化分离牙乳头，置 半固态培养基培养6 d，半固态培养基中单独加入重组TGFβ1、BMP2，或分别与肝素联合，或TGFβ1和BMP2联合，组织学观察牙乳头的形态学变化。结果：TGF-β1或BMP2 单独 加入时未见细胞极化， 但基质分泌增加。TGF-β1或BMP2 加 肝素可诱导牙乳头周边细胞发生极化，并分泌胞外基质。半固态培养基中同时加入 TGF-β1和BMP2的牙乳头培养6 d后，牙乳头周边细胞出现极化和功能性分化，牙乳头周边胞外基质沉积明显，且可见牙乳头尖形态的维持及从牙乳头尖至牙乳头 基底部成牙本质细胞分化梯度的维持。结论：本研究结果证实，在没有内釉上皮和完整的基底膜存在的情况下，TGF-β1和BMP2加肝素可诱导培养的牙乳头出现成牙本质细胞分化，并促进胞外基质的分泌。TGF-β1和BMP2 均能诱导成牙本质细胞的细胞学分化和分泌功能，二者联合应用可协同发挥作用增强诱导效果。

　　［关键词］  转化生长因子β1  骨形成蛋白  成牙本质细胞分化  牙乳头

　　Transforming Growth Factor β1 (TGFβ1) and Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) Induce Odontoblast-like Cell Differentiation in vitro.

　　ZHU Qi, FAN Ming-wen, ZHANG Qi, et al.

　　Key Laboratory for Oral Biomedical Engineering, Ministry of Education, School of Stomatology, Wuhan University, Wuhan 430079

　　［Abstract］Objective: To study the effects of transforming growth factor β1 (TGFβ1) and bone morphogenetic protein2 (BMP2) on the differentiation of odontoblasts in vitro. Methods: Trypsin-isolated dental papillae cells from day 17 mandibular first molar were cultured in semi-solid medium for 6ds. Results: Both TGFβ1 and BMP2 stimulated the matrix secretion by dental papillae cells, TGFβ1 and/or BMP2 combined with heparin, stimulated the functional differentiation of odontoblast-like cells and matrix secretion at the periphery of dental papillae. Conclusions: These results demonstrate that both TGFβ1 and BMP2 stimulate the cytological and functional differentiation of preodontoblasts, and both molecules can act synergistically with each other to strengthen their inductive effects.

　　［Key words］  Transforming growth factor-β1  Bone morphogenetic protein  Odontoblast differentiation  Dental papillae

    发育中的牙胚是研究控制组织形态发生和细胞分化的上皮－间充质相互作用的分子机制的有效模型。在牙形态发生早期，成牙本质细胞为高柱状有丝分裂终末细胞，呈单层排列，通过连续的基底膜与内釉上皮相互作用。功能性成牙本质细胞合成并分泌前期牙本质和牙本质的胞外基质成份。成牙本质细胞呈现特异的形态学、细胞学和功能上的特征［1］。成牙本质细胞的终末分化包括以下步骤：前期成牙本质细胞退出细胞周期，出现极化和分泌前期牙本质基质成份。胞外基质成份包含胶原、磷蛋白、牙本质基质蛋白1和牙涎蛋白［2］。实验研究揭示内釉上皮通过基底膜介导的相互作用控制成牙本质细胞的终末分化［3，4］。包含生长因子在内的细胞外基质成份可能在这种相互作用中对前期成牙本质细胞的形态和功能上的转变发挥重要作用［5］。

    不同的生长因子及其受体在牙发育过程中在其mRNA 或蛋白质水平检测到［6~8］。当成釉细胞转化为分泌性时，TGF-β1 mRNA的表达从内釉上皮转移到成牙本质细胞层［9］。研究显示BMP2可能在牙齿形态发生过程的不同阶段发挥作用［10，11］。BMP2 mRNA 局限于牙胚的间充质细胞，在细胞分化过程牙胚经胰酶消化后，机械分离牙乳头（DP），包埋于12 μL半固态培养基，然后将牙乳头置放于微孔滤膜上，在含2.5 mL液态培养基的支架培养体系培养6 d，每2 d换液一次

　　图1  牙乳头培养程序示意图　略

　　中在成牙本质细胞表达显著增加。体外加入牙本质蛋白成份可诱导分离牙乳头的成牙本质细胞分化［11，12］。该结果显示一些特异性生长因子能模拟内釉上皮的作用诱导成牙本质细胞的功能性分化。

    本研究中，我们观察TGF-b超家族的两个成员，TGF-β1和BMP2 单独或联合加入体外培养的牙乳头对成牙本质细胞分化的影响。组织学观察细胞的极化和前期牙本质样基质的分泌， 作为前期成牙本质细胞功能性分化的指标。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料  人重组TGF-β1（Sigma, USA），人 重组 BMP2（中国军事医学科学院）。

　　1.2  小鼠牙胚的获取和牙乳头的分离  小鼠交配后的胎龄计算以见到阴道栓时定为零天。将怀孕17 d昆明小鼠断颈处死，取出胚胎。分离鼠胎下颌并于体式显微镜下分离下颌第一磨牙牙胚，用含1%胰蛋白酶（Difco, 1∶250）的Hank’s液4 ℃下消化45 min。机械分离牙乳头组织和成釉器，然后将牙乳头用FCS/Hank’s（V/V, 1/1）漂洗两次以抑制酶的活性。

　　1.3  牙乳头体外培养  新分离的D17牙乳头包裹于含10 μL的RPMI-1640半固态培养基的微孔，培养基含维生素C( 0.2 mg/mL)、青霉素(50 u/mL)、链霉素 (0.05 mg/mL)、HEPES ( 20 mmol/L)， FCS (20%),琼脂(0.5%)。半固态培养基固化前按下述加入2 μL的生长因子和肝素：TGFβ1 （50 ng） 、BMP2 （1 μg ）、TGFβ1 （50 ng）+肝素（1.2 μg） 、BMP2 （1 μg ）+肝素（1.2 μg）、TGFβ1 （50 ng）+BMP2 （1 μg ）、肝素1.2 μg、空白对照（未加生长因子与肝素）。各种生长因子混合后4℃预孵1小时以使其相互作用。包裹了牙乳头的琼脂块置于微孔滤膜上，在2.5 mL液体培养基成分同上述半固态培养基，但不含琼脂上支架培养，于37 ℃含5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养6 d，每48 h更换液体培养基1次，见图1。

　　图2 －　图4  略

　　图5  －　图7  略

　　1.4  组织学观察  终止培养的鼠牙乳头用Bouin’s液固定，石蜡包埋，制作5 μm厚连续组织切片，Mallory Alun苏木素精染色，镜下观察。

　　2  结果

　　2.1  培养于对照组的牙乳头  空白对照组（n=18）和半固态培养基中单独加入肝素（n=22）的牙乳头培养6 d后，均未出现牙乳头周边细胞分化为成牙本质细胞和胞外基质的沉积，见图2、图3。

　　2.2  TGFβ1或BMP2单独加入的效果  半固态培养基中单独加入TGF-β1（n=12）和BMP2（n=16）的牙乳头培养6 d后，未观察到牙乳头周边成牙本质细胞分化。但部分牙乳头（10/12,13/16）周边或牙乳头内部出现胞外基质分泌明显增加，见图4、图5。

　　2.3  TGFβ1或BMP2与肝素联合加入的效果  半固态培养基中加入TGF-β1-HN（n=11）和BMP2-HN(n=18)的牙乳头培养6 d后，部分牙乳头（7/11,16/18）周边细胞出现成牙本质细胞样细胞，细胞极化和功能性分化，细胞变为高柱状，胞核伸长，位于细胞基底部，牙乳头周边沉积一层胞外基质，见图6、图7。

　　2.4  TGFβ1和BMP2联合加入的效果  TGFβ1和BMP2联合加入培养基也能诱导部分牙乳头(12/14)成牙本质细胞的极化，见图8。培养6 d后，极化的成牙本质细胞开始在与半固态培养基接触的组织块周围分泌大量的细胞外基质。

　　图8  略

　　3  讨论

    成牙本质细胞是一种有丝分裂终末细胞， 实验研究揭示，在前期成牙本质细胞获取对上皮源信号的反应能力之前的细胞周期存在一内在决定机制，而这种上皮源信号启动成牙本质细胞的终末分化。TGF-β超家族成员诱导成牙本质细胞分化的梯度，说明活性分子在琼脂固化培养基可维持数天，前期成牙本质细胞的分化潜能呈进行性或细胞动力学依赖性表达。单独加入重组生长因子（rBMP2, rTGFβ1或rIGF-1)至半固态培养基不能诱导牙乳头的前期成牙本质细胞分化。然而，当与肝素联合加入时这些生长因子则产生阳性的效果：rBMP2或 rTGFβ1 与肝素联合可诱导牙尖端的功能性分化，rIGF-1与肝素则诱导广泛的细胞学分化， 但无尖端基质沉积［11］。这些结果提示重组生长因子与肝素的预孵是诱导成牙本质细胞终末分化的前提。

    本研究揭示了TGF-β1和BMP2均参与了前期成牙本质细胞的极化和基质分泌。当TGF-β1或BMP2单独加入培养基时，牙乳头组织未出现成牙本质细 胞分化。TGF-β1或BMP2与肝素联合加入半固态培养基时，可出现明显的成牙本质细胞 形态学和功能上分化：细胞排列整齐、伸长并发生极化，细胞分泌胞外基质。极化细胞在牙乳头周边分泌大量的胞外基质。有研究显示胞外基质与生长因子间可能存在协同作用。肝素可能加强培养体系中TGF-β1和BMP2的活性［11，13］。在本实验条件下生长因子在局部的效果应归因于外源性生长因子从琼脂多孔结构中扩散减少。TGF-β1和BMP2均能与肝素结合 的特性，阻止了TGF-β1、BMP2在牙乳头组织内的扩散，增强了生长因子的活性。肝素与生长因子作用的分子机制仍不清楚。它可能改变了生长因子与胞外基质的相互作用。其机制可能为生长因子与胞外基质的硫酸肝素侧链的粘附受到抑制， 从而促进与靶受体的结合与作用。

    本研究还发现TGF-β1和BMP2联合加入培养基也产生阳性结果。TGF-β1和BMP2联合可诱导组织块周边的细胞极化和基质沉积。此结果不同于Begue-Kirn等 的报道［11］。Begue-Kirn等使用15 ng BMP2 培养牙乳头，这种情况下由于生长因子的扩散导致TGF-β1和BMP2联合加入培养基产生阴性结果，而我们采用的浓度为1 μg BMP2，尽管有BMP2扩散发生， BMP2的浓度足以诱导成牙本质细胞分化和基质的分泌。

    有些培养的牙乳头组织块内出现基质堆积， 可能是由于外源性生长因子向牙乳头内部扩散所致。所以，TGF-β1和BMP2联合加入，除了其协同作用外， 也部分的预防了生长因子的扩散， 以使成牙本质细胞样细胞对信号分子的诱导产生反应［16］。

    本研究证实，在没有内釉上皮和完整的基底膜存在的情况下，生长因子TGF-β1、 BMP2加肝素，或者TGF-β1和BMP2联合可诱导培养的牙乳头出现成牙本质细胞样细胞分化，并促进胞外基质的分泌。

　　参考文献

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