PRP，BPBM联合GTR修复犬牙Ⅱ度根分叉病变的研究

作者：詹暶， 张志兴， 闫福华    作者单位：福建医科大学 附属口腔医院牙周科，福州 350002

【摘要】  目的 应用富血小板血浆（PRP）、多孔牛骨无机材料（BPBM）和引导组织再生术（GTR）联合修复犬牙Ⅱ度根分叉病变，探讨其是否能增强GTR的疗效。 方法 人工构建Beagle犬下颌第一磨牙和第二、三前磨牙Ⅱ度根分叉病变模型，随机采用GTR/PRP/BPBM（实验组）或GTR（对照组）治疗，12周后经组织学观察牙周组织再生情况。 结果 GTR组的新生牙骨质长度和新生牙槽骨面积分别为（57.7±7.8）%和（30.8±7.4）%，GTR/PRP/BPBM组为（76.3±10.1）%和（59.9±13.1）%，两组比较差别无统计学意义。 结论 在本实验条件下，PRP复合BPBM不能明显增强GTR对Ⅱ度根分叉病变的再生作用。

【关键词】  根分叉病变；引导组织再生，牙周； 血小板，血浆置换；疾病模型，动物

　　ABSTRACT:  Objective  The purpose of this study was to evaluate the effectiveness of plateletrich plasma（PRP）, bovine porous bone mineral （BPBM）and guided tissue regeneration （GTR） used in combination，compared to GTR alone in the treatment of grade Ⅱ molar furcation defects in dogs.  Methods  Class Ⅱ periodontal furcation defects model in six adult Bealge dogs were created surgically and subsequently treated with either GTR alone or a combination of GTR/BPBM/PRP.  The animals were sacrificed at 12 weeks postsurgery for histologic analysis.  Results  The percentage of new cementum length and new alveolar area in GTR and GTR/BPBM/PRP was 57.7±7.8, 76.3±10.1 and 30.8±7.4, 59.9±13.1.  No statistically significant differences were observed between the two groups.  Conclusion  The results suggested that PRP/ BPBM added no benefit to GTR in the treatment of grade Ⅱ molar furcation defects.    　　KEY WORDS:  furcation defect; guided tissue regeneration,periodontal; blood platelets; plasma exchange; disease models, animal

　　根分叉病变因其骨破坏形式和解剖结构的特殊性，是牙周病治疗中的难点。引导组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）是治疗根分叉病变的常用技术，但有研究认为单纯GTR的疗效并不能肯定，如与其他生物材料和生长因子联合应用，可能更有助于促进牙周组织的再生[1]。本实验的目的是探讨富血小板血浆（plateletrich plasma，PRP）复合多孔牛骨无机材料（bovine porous bone mineral,BPBM)能否增强GTR治疗犬Ⅱ度根分叉病变的疗效。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  成年雄性Beagle犬6只[福州振华实验动物有限公司提供（合格证：闽实动字准第200208）]，体质量25～30 kg。BioGide胶原膜，BioOss骨粉（美国Osteohealth公司）；瞬康医用胶（北京瞬康医用胶有限公司）；显微镜（IX 71，日本Olympus公司）。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  根分叉病变模型建立  参照文献[2]方法制备：氯胺酮10 mg/kg肌注诱导麻醉后，静脉滴注氯胺酮 1～2 mg/kg，安定0.1 mL/kg维持麻醉。常规翻瓣，在受试牙（每只犬下颌第3、4前磨牙和第一磨牙）根分叉颊侧造成垂直向5 mm，近远中向5 mm，颊舌向3 mm的牙槽骨U型缺损，暴露颊侧根分叉及根面，彻底刮除根面牙周膜，并在暴露根面放置牙胶，缝合龈瓣，覆盖牙胶，6周后即形成Ⅱ度根分叉病变实验模型。

　　1.2.2  PRP的制备  参照文献[3]方法制备  抽狗动脉血20 mL(按1∶9的比例预先在试管中加入2 mL 10%枸橼酸钠抗凝剂)，放置离心管，1 000 r/min离心15 min后取上清，再次3 000 r/min离心8 min后弃上清（乏血小板血浆）后混匀即形成PRP。使用前先进行血小板计数，并与全血比较，使用时将PRP与适量BPBM混合后植入缺损区。

   　1.2.3  根分叉病变治疗  36颗受试牙随机分为3组：GTR组7颗；GTR/PRP/BPBM组7颗；剩余牙用于其他实验研究。

　　1.2.4  组织标本制备  术后12周将狗统一处死，用慢速手机将标本从根分叉处沿近远中向片切成块，10%甲醛固定3 d，Krinstensen′s液脱钙，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，制备5 μm厚的切片，苏木素伊红染色。

　　1.2.5  组织学观察和测量指标  OLYMPUS IX 71显微照相系统和相应软件计算新生牙骨质长度的百分比和新生牙槽骨面积的百分比。新生牙骨质长度百分比的计算方法：将位于根面标记点冠方所有新生牙骨质的长度相加除以标记点上方的根面总长。新生牙槽骨面积百分比的计算方法：将根分叉区内根面标记点上方的新生牙槽骨面积除以标记点上方的根分叉区总面积（图1）[4]。

　　1.3  统计学方法  采用SPSS 11.0统计软件包进行统计学分析。数据以x±s表示，采用t检验，P<0.05为有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  血小板计数  全血血小板计数为(179.17±38.13)×109 L-1。PRP血小板计数为（2 501.67±1 233.73）×109 L-1，其血小板浓度约为全血的14倍。

　　2.2  组织学分析  共13颗实验牙，GTR组7颗，PRP组6颗（因制备标本时处理不当而遗弃一颗）。光镜下可见GTR/PRP/BPBM组及GTR组均有新生牙槽骨和新生牙骨质样组织生长，表现为自根方切迹处向冠方生长，与原有牙槽骨和牙骨质连为一体。新生牙槽骨矿化程度较低，其表面可见较多成骨细胞连续排列。新生牙骨质在有些牙根表面呈不连续再生，绝大部分与切迹根方原有牙骨质相连。在新生牙槽骨和新生牙骨质样组织的间隙内有斜行及平行的纤维穿行，且可见新生血管，未见根骨粘连和牙根吸收（图2）。

　　图1  新生牙骨质长度和新生牙槽骨面积的计算方法（略）

　　Fig 1  Schematic drawing of morphometric analysis of percentage of new cementum length and percentage of new bone area

　　N：切迹，NC：新生牙骨质，NB：新生牙槽骨.  A：可见切迹上方NC及NB（HE染色×20）；B：切迹处放大图，可见新生牙槽骨和牙骨质表面有成骨细胞（箭头1）和成牙骨质细胞（箭头2）连续排列（HE染色×40）.

　　图2  GTR/PRP/BPBM组切迹处的牙周组织再生图（略）

　　Fig 2  Periodontal tissue regeneration in the notch area in group of GTR/PRP/BPBM

　　2.3  组织形态学测量分析  GTR组的新生牙骨质长度和新生牙槽骨面积的百分比分别为(57.7±7.8)和(30.8±7.4)，GTR/PRP/BPBM组为(76.3±10.1)和(59.9±13.1)，2组比较差别无统计学意义。

　　3  讨论    　　BPBM是一种可吸收性牛骨无机材料，其结构与人的网状骨相似，与GTR联合应用能促进牙周组织再生[5]，而PRP富含多种能促进牙周组织再生的生长因子[1]，因此，将GTR、BPBM和PRP三者联合应用可能有助于增强GTR的再生疗效。但本实验结果显示PRP/BPBM不能明显增强GTR的疗效，与陈超等的研究结果相似[6]，推测除了缺损类型可能影响再生效果，还可能与下述因素有关。

　　3.1  PRP中的血小板浓度  血小板是PRP中生长因子的主要来源，它的浓度因制备方法的不同而不同[7]。Marx认为血小板浓度为全血4～5倍的PRP才是“有疗效”的PRP，浓度过小可能达不到应有的效应，太大则对骨再生有抑制作用[8]。刘彩霞等将3种不同方法制备的PRP用于牵张成骨，结果显示PRP中血小板浓度为全血的500%左右为最佳,与Marx的观点相同[7]。Weibrich也发现PRP促进兔股骨种植体周围骨缺损再生的血小板最佳浓度为4～7倍[9]。而本实验中PRP中的血小板浓度高达全血的14倍左右，但因根分叉区牙周组织的再生涉及多种细胞成分，较体外单一的细胞培养和体内单纯的骨再生更为复杂，Marx所提倡的最佳浓度是否也适用于牙周组织再生还有待研究。

      3.2  凝血酶的浓度  PRP内生长因子的释放有赖于凝血酶的激活。而凝血酶的浓度对PRP内生长因子的释放量有一定影响[10]。目前多数实验是采用一定浓度的牛凝血酶和氯化钙在体外与PRP混合，形成凝胶后再用于术区。考虑到外源性凝血酶的应用可能增加发生危及生命的凝血病的风险[11]，而牙周韧带细胞和成骨细胞本身可分泌凝血酶[12]，因此本实验未使用外源性牛凝血酶，而是将PRP与BPBM混合后直接植入根分叉病变区，期望通过自体凝血酶激活PRP，以寻找更安全有效的作用方式。YassibagBerkman 曾用此法将PRP复合βTCP，发现无论是否使用屏障膜都能促进人前牙骨内缺损的牙周组织再生[13]。但用此法无法确定根分叉病变区自体凝血酶的浓度，而且PRP植入缺损区时仍呈液态，依靠骨粉和胶原膜的吸附和覆盖作用而保留在术区，有可能导致部分PRP流失从而影响疗效。因此，尚需探讨自体凝血酶更适宜的用法及用量。

　　3.3  PRP载体的功能  PRP凝胶中血小板内容物（包括生长因子）持续释放最多达1周左右，而创伤的愈合通常需要数月之久[8]。因此，如何使生长因子持续高效稳定地发挥作用是促进组织再生的关键问题之一。生长因子缓释系统的应用可保持生长因子的活性并延长使用时间。BPBM可吸收，具有多孔隙结构,能促进血管再生和凝血块的稳定，有利于生长因子的吸附,其小梁结构与人的网状骨相似，可为细胞的生长和分化提供支架和骨传导作用，符合生长因子缓释系统的标准[14]。虽然BPBM具有缓释载体的条件，但它是否真的能延长PRP内生长因子的释放时间？如能延长，延长的时间是多少？它与PRP中多种生长因子在不同的微环境中是如何相互作用的？今后可对PRP与不同载体间的相互作用机制进行深入研究。

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