兔骨髓间充质干细胞修复面神经缺损的初步研究

作者：余国建　胡勤刚 周炳荣 邓润智 黄晓峰 陈湘华

【关键词】  骨髓间充质干细

　　［摘要］  目的：初步观察骨髓间充质干细胞（MSCs）在面神经缺损修复中的作用。方法：抽取兔骨髓液经Percoll液离心得到单个核细胞，经体外培养、纯化后获得兔骨髓MSCs。15只新西兰白兔的两侧面神经上颊支分别造成12 mm的缺损，一侧硅胶管套管连接后植入MSCs，另一侧单纯硅胶管套管。于术后第4、8、16周行大体观察，测定神经传导速度，处死动物后作组织学检查。结果：第4周时双侧管内未见明显再生神经纤维；第8周和16周时，双侧管内可见再生神经纤维。神经电生理测定和有髓神经纤维计数结果显示， MSCs侧优于单纯套管侧（P<0.05）。结论：MSCs可促进面神经缺损的修复，提示MSCs可应用于修复外周神经缺损。

　　［关键词］  骨髓间充质干细胞  面神经缺损  神经再生

　　The Pilot Study of Regeneration of Facial Nerve Defect with Rabbit Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.

　　YU Guo-jian, HU Qin-gang, ZHOU Bing-rong, et al.

　　Stomatological Hospital Affilliated College of Medicine， Nanjing University,Nanjing 210008

　　［Abstract］Objective: To observe the effect of BMSCs on regeneration of facial nerve defects. Methods: The BMSCs were isolated from the mononucleated cells fraction of rabbit bone marrow by Percoll, and then cultured in vitro. 15 New Zealand rabbits were randomly divided into three groups. Bilateral 12mm defect of superior buccal divisions of the facial nerves were made in rabbits. Silicone conduit containing BMSCs was implanted into one gap, and single Silicone conduit was implanted into the another gap as control. The nerve regeneration was evaluated with gross appearance, electrophysiological and histological examination at 4, 8 and 16 weeks postoperatively. Results: The regenerated nerve fibers were observed in the conduits of both sides at 8 and 16 weeks after operation, but no regenerated nerve fibers at 4 weeks after operation. Compared with the control side, the experimental side had faster motor nerve conduction velocity and more regenerating myelinated nerve fibers at 8 and 16 weeks postoperatively. There were significant differences in both conditions (P<0.05). Conclusions: BMSCs were proved to have capacity for facilitating the peripheral-nerve regeneration. The study indicated that BMSCs may be used in regeneration of peripheral-nerve defects.

　　［Key words］  Bone marrow mesenchymal stem cells  Facial nerve defects  Nerve regeneration

    外周神经缺损后的修复是临床迫切需要解决的难题之一，目前常用神经移植、套管法修复，但其适应症常受到限制。近十几年来，随着组织工程技术的发展，许多学者通过植入体外培养的雪旺细胞来修复外周神经缺损，取得了一些效果。但雪旺细胞存在来源有限和异体免疫排斥等问题，限制了其在修复外周神经缺损中的应用。而骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，因其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，方便取材，体内植入后不良反应较小等优点而备受关注［1，2］。近几年来，国外相继报道［3~5］MSCs有向外胚层的神经胶质细胞分化的潜能。本研究主要采用体外分离、培养的兔骨髓MSCs植入面神经缺损的硅胶套管内，以期其能分化为雪旺细胞，促进缺损面神经的修复，为临床修复外周神经损伤或缺损开辟了一条新途径。

　　1  材料与方法

　　1.1  兔骨髓间充质干细胞的体外分离与培养  按Kadiyala等［6］描述的方法进行，5月龄的新西兰白兔，雌雄不限，骨髓穿刺针接5 mL注射器，注射器内含稀释的肝素钠3 000 U 0.2 mL。从髂后上棘穿刺，抽取骨髓液4 mL，经PBS液1∶3稀释后，以1∶1缓慢注入预先加入密度为1.073 g/mL Percoll液的试管内，密度梯度离心，2 000 rpm，30 min，吸取中间的单个核细胞层，PBS液洗2次，以2×105/mL的浓度接种于50 mL培养瓶内，加5 mL L-DMEM液（含青霉素钠100 U/mL，链霉素100 μg/mL），加入胎牛血清终浓度为10％。在5％CO2孵箱内37 ℃培养4 d。更换培养液，将未贴壁的细胞弃除，以后每3 d换液一次。12~14 d后基本长满单层，用0.25％胰蛋白酶消化1~2 min，再用细胞刮子刮落贴壁细胞，即得到原代培养的MSCs悬液。再以8×104/mL的细胞浓度传代培养。取第3代MSCs植入缺损区的硅胶管内 。

　　1.2  面神经缺损模型制备  将新西兰白兔肌注麻醉，沿兔下颌骨下缘上15 mm切开，暴露并游离兔面神经上颊支，在无张力状态下居中切除12 mm神经，在外科显微镜下用11-0无损伤缝合线与直径2 mm的硅胶管连接，缝合时应避免神经张力过大或扭曲，分层缝合手术切口。术后肌注庆大霉素4万U/d，连续3 d。

　　1.3  MSCs的植入  取体外培养的第3代兔骨髓MSCs，用含10％FBS的L-DMED制成细胞悬液，细胞浓度为8×105/mL。15只新西兰白兔双侧面神经缺损模型形成自身对照，随机分为术后第4、8、16周3组，每组5只。一侧单纯硅胶管连接面神经缺损为单纯套管侧；在另一侧硅胶管套管内，注入MSCs悬液至充满套管，细胞数约为1.6×104。

　　2  结果

　　2.1  MSCs的分离、纯化和扩增  用密度为1.073 g/mL 的Percoll液分离骨髓，收获单个核细胞，以2×105/mL的浓度接种于50 mL塑料培养瓶内，4 d后出现散在的贴壁细胞，呈纺锤状。8 d后细胞迅速增值，呈集落样生长，15 d后细胞长满，呈长梭形。消化后的细胞首次1∶1传代，4 h左右贴壁，3~4 d后按1∶2或1∶3传代。传代后细胞增殖迅速。

　　2.2  大体观察  双侧伤口愈合良好，局部未见红肿溢脓，硅胶套管周围均由纤维结缔组织包绕。仔细剥去包绕组织，见双侧硅胶管内有乳白色积液生成。4周时双侧管内未见明显再生神经纤维；8周时双侧管内见近端神经与远端神经相连，中间段较细，用组织镊轻拉神经近端，再生神经易断；16周时双侧管内再生神经纤维增粗，直径约近端神经干直径1/2~2/3。

　2.3  神经电生理  术后第4、8、16周，分别检测双侧面神经上颊支的运动神经传导速度。第4周时未检出；第8周和16周时，MSCs侧神经传导速度均高于单纯套管侧，见表1，t检验显示两者均有显著性差异（P<0.05）。

　　表1  第8周和第16周时运动神经传导速度　略

　　表2  有髓神经纤维计数　略

　　2.4  组织学检查结果  HE染色切片（×200）显示，第4周时，两侧硅胶管内未见明显再生神经纤

　　图1 － 图4  略

　　维，两侧远端可见变性神经纤维，束膜结构不完整。第8周时，MSCs侧硅胶管内再生神经纤维稍紊乱，但已形成束状结构，血管增生较明显，见图1，其远端见变性神经纤维，偶有空泡性变；单纯套管侧硅胶管内再生神经纤维排列较紊乱，见图2，其远端见变性神经纤维和空泡性变。第16周时，MSCs侧硅胶管内再生神经纤维增粗，形成束状结构，神经束增多，血管增生明显，见图3，其远端少见变性神经纤维，无空泡性变；单纯套管侧硅胶管内再生神经纤维束增多，束与束之间被大量纤维组织分隔，见图4，其远端仍见变性神经纤维，偶见空泡性变。第8周和16周时，再生神经的有髓神经纤维计数，MSCs侧均高于单纯套管侧，见表2，且差异显著（P<0.05）。

　　3  讨论

    雪旺细胞是外周神经的主要结构和功能细胞，在神经再生中起重要作用。在外周神经损伤后，雪旺细胞分裂、增殖形成Büngner带，引导轴突生长，并能分泌10余种雪旺细胞源性神经营养因子（SDNF），起到避免外周神经损伤后引起的神经元逆行性死亡，引导和促进轴突再生以及促进髓鞘形成的作用。研究者们通过植入体外培养的雪旺细胞来修复外周神经缺损，取得了一些成果。

    骨髓间充质干细胞是目前研究较多的一类具有多向分化潜能的干细胞。近来的研究发现，MSCs可以分化为神经细胞。南佛罗里达大学的Sanchez-Ramos J［3］体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞。Gene C.Kopen等［4］将荧光标记的骨髓间充质干细胞植入新生鼠的前脑和小脑内后分化为神经胶质细胞。S.Ausim Azizi等［5］报道，将人骨髓间充质干细胞荧光标记后植入白鼠脑室内，能够分化为神经胶质细胞样细胞。

    基于以上的研究成果，本实验把MSCs运用于面神经缺损的修复中，期望其能在神经断端分泌的神经营养因子等内环境的诱导下，分化为雪旺细胞，从而促进面神经再生。因为MSCs具有来源广泛、取材方便和无异体免疫排斥反应等优点，可克服雪旺细胞在这方面的不足，成为修复外周神经缺损的良好的种子细胞。

    常用的外周神经再生评价指标［7］主要有大体观察、神经电生理、肌肉湿重和周径测定、有髓神经纤维计数、HE染色、电镜观察，针对面神经还有面神经功能评分等。本实验采用大体观察、运动神经传导速度、HE染色和有髓神经传导速度四个观察指标，从形态和功能两方面评价面神经的再生情况。本实验采用异质性较小的新西兰白兔为实验对象，造成双侧面神经缺损模型，形成自身对照，因此很难进行面神经功能评分。至于神经所支配的肌肉湿重在实际操作中很难准确测定，而且两侧的差异很小，而手术操作的误差很大，我们认为此指标在本实验中意义不大。

    在本实验中，术后第8、16周时，对MSCs侧和单纯套管侧进行运动神经传导速度测定证实了再生神经功能的存在，统计学处理的结果表明MSCs侧的神经功能恢复优于单纯套管侧，并且差异显著。同时，对这两组动物双侧套管内再生神经进行了有髓神经纤维计数，结果MSCs侧的再生神经数量均多于单纯套管侧，统计学处理表明双侧差异显著，这说明MSCs侧在缺损外周神经的功能和形态恢复都快于单纯套管侧，从而为MSCs促进面神经再生提供了较客观和直接的证据。

　　参考文献

　　［1］  Pittenger MF, Mackay AM, Stephen CB, et al. Mutilineage potential of adult human mesenchymal stem cells ［J］. Science,1999, 284（4）∶143-147

　　［2］  Ferrari G, De Angelis GC, Coletta M, et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors ［J］.Science,1998, 279 (6)∶1 528-1 530

　　［3］  Sanchez-Ramos J, Song S, Cardoso-Pelaes F, et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro ［J］. Exp Neural, 2000,164(2)∶247-256

　　［4］  Gene C.Kopen, Darwin J Prockop, Donald G Phinney. Marrow stromal  cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they  differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains ［J］. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999,96（6）∶10 711-10 716

　　［5］  S.Ausim Azizi, David Stokes, Brian J Augelli, et al. Engraftment and   migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats-similarities to astrocyte grafts ［J］. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1998,95（4）∶3 908-3 913

　　［6］  Kadiyala S, Young RG, Thiede MA, et al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro ［J］. Cell Transplant,1997,6（1）∶125

　　［7］  Tohill M, Mantovani C, Wiberg M, et al. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration ［J］. Neurosci Lett， 2004 May 27;362(3)∶200-203

　　作者简介  余国建（1978~ ），男，浙江绍兴人，住院医师，硕士，主要从事干细胞的研究。