痛经合剂质量标准研究

　　作者：翁燕,刘志辉　　作者单位：江苏省中医院,江苏 南京

　　【摘要】 目的 建立痛经合剂的质量标准。方法 采用薄层色谱法(TLC)对制剂中川芎、延胡索、香附、赤芍进行定性鉴别。采用高效液相色谱法(HPLC)测定制剂中阿魏酸含量,采用Hedera C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.085%磷酸(15∶85)为流动相,流速1.0 mL/min,检测波长316 nm,柱温35 ℃。结果 薄层色谱斑点清晰,方法专属性强,阴性对照无干扰。阿魏酸进样量在23.4～311.7 ng范围内呈良好的线性关系,r=1.00(n=5),平均回收率为96.17%, RSD=2.24%(n=6)。结论 本研究建立的TLC和HPLC方法专属性强、重复性好,可用于痛经合剂的质量控制。

　　【关键词】 痛经合剂;质量标准;薄层色谱法;高效液相色谱法;阿魏酸

　　Abstract：Objective To establish the quality standard of Tongjing mixture. Methods Rhizoma Chuanxiong, Rhizoma Corydalis, Rhizoma Cyperi and Radix Paeoniae Rubra were identified by TLC. HPLC was used to determine the content of fenllic acid on Hedera C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was consisted of acetonitrile-0.085% phosphoric acid (15∶85), the flow rate was 1.0 mL/min, the detection wavelength was 316 nm and the column temperature was 35 ℃. Results The spots of TLC were clear, with strong specificity and no interference. The linear range of fenllic acid was within 23.4-311.7 ng, r=1.00 (n=5). The average recovery was 96.17% and RSD was 2.24% (n=6). Conclusion The methods are simple, rapid, accurate and can be used for the quality control of Tongjing mixture.

　　Key words：Tongjing mixture;quality standard;TLC;HPLC;fenllic acid

　　痛经合剂为本院制剂,由当归、川芎、延胡索等10味中药组成,具有活血化瘀、行气止痛的功效,用于治疗痛经。为了控制其质量,保证临床用药安全、有效,我们采用薄层色谱法(TLC)对制剂中川芎、延胡索等进行定性鉴别,采用高效液相色谱法(HPLC)进行含量测定,建立痛经合剂的质量标准。

　　1 仪器与试药

　　Waters e2695高效液相色谱仪,2998 PDA检测器,EmpowerⅡ色谱工作站(美国);1/10万电子分析天平(BP-211D型,德国Sartorius);玻璃点样毛细管(华西医科大学仪器厂);全自动薄层制版器(939型,重庆市南岸贝尔德仪器技术厂);医用超声波清洗器(KQ-1000E型,昆山市超声仪器有限公司);电热鼓风干燥箱(101-1A型,南通沪通制药机械设备厂);恒温水浴锅(HH-4数显型,江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);凝胶成像分析仪(WD-9413A型,北京市六一仪器厂)。

　　阿魏酸对照品(含量测定用,批号110773-200611)、川芎对照药材(批号120918-200809)、延胡索对照药材(批号120928-200604)、香附对照药材(批号121059-200705)、赤芍对照药材(批号121093-200402)均购自中国药品生物制品检定所;痛经合剂(本院自制,批号100221、100222、100223)。硅胶G(青岛海洋化工集团);薄层色谱所用试剂均为分析纯,高效液相色谱所用试剂为色谱纯,水为超纯水。

　　2 方法与结果

　　2.1 薄层色谱鉴别

　　2.1.1 川芎

　　取本品20 mL(相当于川芎药材2 g),以等量水稀释后,置分液漏斗中,加氨水10 mL,再用二氯甲烷振摇提取3次,每次20 mL,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加乙醇1 mL溶解,作为供试品溶液。另取川芎对照药材2 g,加水20 mL,加热煎煮0.5 h,放冷,滤过,滤液置分液漏斗中,加氨水10 mL,再加二氯甲烷振摇提取3次,每次20 mL,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加1 mL乙醇溶解,作为对照药材溶液。再取除川芎外的其余药材,按制备工艺制成缺川芎的阴性对照溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述3种溶液各20 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(40∶5∶0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇,105 ℃烘箱加热至斑点清晰,紫外灯(254 nm,365 nm)下检测。供试品色谱中,在与对照药材相同位置显蓝色斑点,而阴性对照品未见干扰[1]。

　　2.1.2 延胡索

　　取本品20 mL(相当于延胡索药材2 g),以等量水稀释后,置分液漏斗中,加氨水调至碱性,然后用乙醚振摇提取3次,每次30 mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加乙醇1 mL溶解,作为供试品溶液。另取延胡索对照药材1 g,加甲醇50 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10 mL使溶解,加氨水调至碱性,用乙醚振摇提取3次,每次10 mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为对照药材溶液。再取除延胡索外的其余药材,按制备工艺制成缺延胡索的阴性对照溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以甲苯-丙酮(9∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,置碘缸中熏至斑点清晰后取出,挥尽板上吸附的碘后,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点,而阴性对照品未见干扰[2]94。

　　2.1.3 香附

　　取本品50 mL(相当于香附药材5 g),以等量水稀释后,置分液漏斗中,用乙醚振摇提取3次,每次30 mL,合并乙醚液,挥干,残渣加乙酸乙酯2 mL溶解,作为供试品溶液。另取香附对照药材1 g,加乙醚5 mL,放置1 h,时时振摇,滤过,滤液挥干,残渣加乙酸乙酯0.5 mL使溶解,作为对照药材溶液[2]181。再取除香附外的其余药材按制备工艺制成缺香附的阴性对照溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述3种溶液各5 μL,点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(15∶5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,加热至斑点显色清晰。待薄层板冷却至室温后,置紫外光灯(365 nm) 下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点,而阴性对照品未见干扰。

　　2.1.4 赤芍

　　取本品20 mL(相当于赤芍药材2 g),以等量水稀释后,用乙酸乙酯振摇提取3次,每次20 mL,合并乙酸乙酯液,置蒸发皿中水浴蒸干,残渣加乙醇1 mL溶解,作为供试品溶液。另取赤芍对照药材0.5 g,加乙醇10 mL,振摇5 min,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇2 mL使溶解,作为对照药材溶液。再取除赤芍外的其余药材按制备工艺制成缺赤芍的阴性对照溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上。以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上显相同的蓝紫色斑点,而阴性对照品未见干扰[2]109。

　　2.2 含量测定

　　2.2.1 色谱条件

　　色谱柱：Hedera C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流动相：乙腈-0.085%磷酸溶液(15∶85);检测波长：316 nm;柱温：35 ℃;进样量：10 μL;流速：1.0 mL/min[2]89。

　　2.2.2 溶液制备

　　对照品溶液：精密称取置五氧化二磷干燥器中干燥12 h的阿魏酸对照品9.74 mg,加70%甲醇溶解,制成每毫升含阿魏酸7.79 μg的对照品溶液。供试品溶液：精密吸取痛经合剂5 mL,置50 mL容量瓶中,加70%甲醇适量,摇匀,再加70%甲醇至刻度,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液即得。阴性对照品溶液：考虑到当归、川芎中均含有阿魏酸,因此取处方中除当归、川芎以外的各味药材,按痛经合剂制备工艺制成阴性对照品溶液。

　　2.2.3 系统适用性试验

　　分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪中,供试品与对照品在相同位置有较大吸收,阴性对照品无干扰。色谱柱的理论塔板数按阿魏酸峰计算大于5 000,分离度大于1.5。见图1。ABC注：A.对照品;B.供试品;C.阴性对照品;1.阿魏酸图1 痛经合剂HPLC图谱

　　2.2.4 线性关系考察

　　分别精密吸取浓度为7.79 μg/mL的对照品溶液3、5、10、20、40 μL,注入高效液相色谱仪中测定。以进样量为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,进行线性回归,得线性方程Y=4 635 658X-11 015,r=1.00,阿魏酸进样量在23.4～311.7 ng范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

　　2.2.5 精密度试验

　　取同一对照品溶液,注入高效液相色谱仪,重复测定6次,以峰面积计算,RSD=0.22%(n=6)。

　　2.2.6 重复性试验

　　取本品(批号100221)6份,按供试品溶液制备方法制备并测定,结果阿魏酸含量分别为102.70、101.35、102.27、102.61、101.41、100.22 μg/mL,RSD=0.93%。

　　2.2.7 稳定性试验

　　取本品(批号100222)按供试品溶液制备方法制备,于0、2、4、6、8、12 h分别进样,测定峰面积, RSD=0.43%,说明本品在12 h内稳定。

　　2.2.8 加样回收率试验

　　精密吸取已知含量的本品(批号100221)6份,分别精密加入阿魏酸对照品溶液(389.6 μg/mL),按供试品溶液制备方法制备并测定,结果见表1。表1 阿魏酸加样回收率试验结果

　　2.2.9 样品含量测定

　　取3批(批号100221、100222、100223)样品,每批2份,按供试品溶液制备方法制备,进样10 μL,测定并计算。结果3批样品中阿魏酸的含量分别为101.68、102.04、102.52 μg/mL。

　　3 讨论

　　赤芍薄层鉴别曾参考文献[3]处理供试品：先以石油醚萃取,弃去石油醚层后,水层加水饱和正丁醇萃取3次,合并正丁醇萃取液,加1%NaOH洗涤2次,再用正丁醇饱和水洗至中性。正丁醇萃取液置蒸发皿中水浴蒸干,残渣加乙醇溶解。此方法可以去除较多与鉴别无关的杂质。但改用乙酸乙酯直接萃取后,鉴别斑点仍很清晰,且方法简单可行。

　　在薄层色谱中,以对照药材作为对照与以对照品为对照相比,可以比较全面地反映该味药在制剂中的性质。对于有效成分明确但专属性差的饮片,用药材作为对照进行定性鉴别更为合理。故本试验薄层鉴别均采用药材(川芎、延胡索、香附、赤芍)作为对照。

　　参考文献[2]方法,阿魏酸对照品溶液制备所用的溶剂为70%甲醇。同样,样品溶液的制备“痛经合剂取样5 mL,加70%甲醇至50 mL,摇匀”,样品溶液中甲醇的浓度可达60%以上,与对照品溶液制备所用的溶液浓度相近,既可使痛经合剂中的大分子物质沉淀,便于去除杂质,减少干扰,同时也有利于目标成分的溶解,便于测定。

　　【参考文献】

　　[1] 谢和兵,刘志辉,钱芳.补阳还五合剂中川芎薄层定性方法研究[J].中国药事,2008,22(5)：420-421.

　　[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社,2005.

　　[3] 谢和兵,刘志辉,钱芳.补阳还五合剂薄层定性鉴别[J].中国药业,2008, 17(4)：29-30.