ApoE基因多态性、hsCRP与冠心病的相关性研究

　　作者：黄跃斌,何印蕾　　作者单位：广西教育厅课题(桂教科研[2006]26号，No.200610LX104);广西百色市科技局科研课题(右医附院院字[2006]66号) (右江民族医学院医学检验学院，广西 百色 533000)

　　【摘要】目的分析载脂蛋白E(ApoE)的基因多态性、高敏C反应蛋白(hsCRP)含量与冠心病的相关性。方法 采用酚氯仿抽提核酸法从凝血块中分离,应用聚合酶链反应(PCR)，Hha1内切酶消化法对94例冠心病患者和100例健康对照组进行ApoE基因多态性进行检测;采用生化全自动仪，以乳胶增强免疫透射比浊法检测血清hsCRP含量。结果 ①ApoE等位基因频率：冠心病组与对照组比较，ε2等位基因频率明显降低(P<0.01)，ε4等位基因频率升高(P<0.005);②血清hsCRP浓度，冠心病组显著升高(P<0.05)，但不同等位基因之间，hsCRP无显著性差别(P>0.05)。结论 联合监测ApoE基因多态性及血清hsCRP含量，对心血管疾病危险性的预测是敏感及有价值的指标。

　　【关键词】 载脂蛋白E,基因多态性,高敏C反应蛋白;冠心病

　　【Abstract】 Objective To analyze the polymorphism of apolipoprotein E (ApoE), and high sensitivity Creactive　protein (hsCRP) levels and the relevance of coronary heart disease (CHD). Methods Phenol chloroform extraction was used to get the DNA from the isolated blocks blood coagulation. Polymerase chain reaction, Hhal endonuclease digestion were used to test the 94 cases of CHD patients and 100 healthy control group ApoE polymorphism. HsCRP level was measured by immune latex transmission turbidity. Results ① ApoE allele frequency: compared with the control group, ε2 allele frequency decreased significantly (P=0.01) in CHD group, ε4 allele frequency increased (P=0.005). ② Serum hsCRP concentration in CHD group was significantly higher than that of control grooup (P<0.05), but there was no significant difference between different alleles on hsCRP. Conclusions The ApoE gene polymorphism and serum hsCRP are the sensitive and valuable indicators, which can predict the the risk of cardiovascular disease.

　　【Key words】 Apolipoprotein E; Genetic polymorphism; High sensitivity Creactive　protein; Coronary heart disease

　　冠心病(CHD)是常见的多发病,是心血管系统疾病常见的死亡原因之一。研究认为，载脂蛋白E(ApoE)基因多态性与CHD有一定的相关性〔1～3〕，冠状动脉粥样硬化并不是一种简单的脂质沉积疾病,炎症是其重要特征,因此,CHD是一种炎性疾病。高敏C反应蛋白(hsCRP)与CHD的关系逐渐被临床广泛关注。本文对94例CHD患者血液进行AopE基因多态性及hsCRP浓度检测，旨在研究血清hsCRP、ApoE基因多态性与CHD的相关性。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 CHD组94例，其中壮族42例，汉族52例，均为右江民族医学院附属医院心内科2007年1月至2007年8月住院CHD患者;男59例，女35例，年龄44～77岁，平均(60±12.7)岁，全部符合1979年世界卫生组织修订的CHD诊断标准。对照组100例，均为同期住院的非CHD患者，并排除心脑血管疾病及肝、肾、内分泌等影响脂质代谢的疾病;男56例，女44例，年龄45～80岁，平均(65±10.8)岁。所有受试者在实验前均知情同意自愿参加本实验。

　　1.2 方法

　　1.2.1 ApoE基因多态性的检测

　　1.2.1.1 DNA提取 采空腹静脉血2.5～3.0 ml，EDTA抗凝，用低渗溶血酚氯仿抽提白细胞核酸DNA，双蒸水溶解后作为模板。

　　1.2.1.2 聚合酶链反应(PCR)扩增 引物设计参考文献〔4〕：引物序列，上游引物P1为： 5′AAC AAC TGA CCC CGG TGG CG3′,下游引物P2为：5′ATG GCG CTG AGG CCG CGC TC3′,由深圳匹基公司合成。PCR反应体系包括10×dNTP(各10 mmol/L)1.0 μl,引物P1和P2各0.8 μl，二甲基亚砜5 μl，DNA模板1.0 μl，Tag DNA聚合酶2 U，加双蒸水至40 μl，混匀即可。PCR反应条件：95℃预变性2 min，然后95℃ 60 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s,共35个循环。用20 g/L琼脂糖凝胶电泳确定特异性扩增产物(292 bp片段)。PCR产物的酶切反应:酶切反应体系包括扩增产物10 U,10×Buffer 5 μl,限制性内切酶Hha1 10 U,加双蒸水至总体积40 μl,置于37℃温育3 h。

　　1.2.1.3 ApoE基因分型 酶切产物经100 g/L聚丙酰胺凝胶电泳,EB染色后紫外线灯下观察,以pBR322DNA/Hae为分子标志物,判断标准参照文献〔5〕方法。

　　1.2.2 hsCRP检测 采空腹静脉血1.0 ml，分离血清，采用日立7060生化全自动仪，以乳胶增强免疫透射比浊法检测。

　　1.3 统计学分析 选用SPSS10.0软件进行t检验。

　　2 结果

　　2.1 ApoE的基因型和等位基因频率比较及其多肽性与血清hsCRP含量关系 见表1，表2。与对照组比较，CHD组和ε2等位基因频率明显降低(P<0.01)，ε4等位基因频率明显升高(P<0.05)。CHD组hsCRP明显高于对照组，而各等位基因组间无显著差异。

　　表1 ApoE基因型和等位基因频率比较(略)

　　与对照组比较：1)P<0.01;2)P<0.05

　　2.2 ApoE的基因型测定 PCR扩增产物经Hha1酶切后，显示有不同的片段长度组合，可以进行ApoE基因型测定，即PCRRFLP分析方法。PCR扩增产物位于ApoE基因第4外显子内，涵盖2个突变位点〔6〕，产物长度为227 bp。纯合子E2/2在91，81 bp出现荧光条带;E3/3在91，48 bp出现荧光条带;E4/4在72，48 bp出现荧光条带;杂合子E4/2在91，81，72，48 bp出现荧光条带;E3/2在91，81，48 bp出现荧光条带;E4/3在91，72，48 bp出现荧光条带。见图1。

　　1:E3/3,2：E2/3,3：E2/4,4：E2/2,5：E3/4,6：E4/4;M：Marker

　　图1 CHD患者ApoE不同基因型电泳图(略)

　　表2 ApoE等位基因多态性与血清hsCRP含量关系(略)

　　与对照组对应等位基因比较：1)P<0.05

　　3 讨论

　　ApoE基因有3个等位基因，即ε2，ε3和ε4，共构成6种不同的基因型：3种纯合型(ε2/ε2，ε3/ε3，ε4/ε4)和3种杂合型(ε3/ε4，ε2/ε3，ε2/ε4)。ApoEε4是脂质代谢紊乱和CHD的重要遗传标记。大多数学者认为，ApoE ε4是早发性CHD发病的独立危险因素〔7〕，CHD患者与对照组人群比较ε2等位基因频率明显降低(P<0.05),说明ApoE基因多态性(ε2等位基因缺失)为CHD的危险因子之一,亦即ε2与CHD成负相关，换而言之，ε2等位基因是CHD的保护因子〔8〕。本研究显示，CHD患者ApoE基因型中，E2/2和E2/3显明性低，而E4/4则显著升高(P<0.05);而等位基因频率中，ε2明显降低，ε4等位基因频率明显高于对照组(P<0.05)，与报道相一致〔9，10〕。表明ε2等位基因是CHD的保护因子，ε4等位基因是动脉硬化发生的潜在因素，ε4等位基因频率上升是CHD的重要标志。

　　hsCRP作为一项心血管病变和CHD发生独立的危险度预测因子， 已受到临床越来越多的重视，hsCRP是由肝细胞产生的一种炎症和组织损伤急性期反应的非常敏感的标志物,动脉硬化是一系列病因所致炎症反应引发炎性细胞和介质造成动脉壁损坏所引起。hsCRP可诱导单核细胞表达组织因子,激活凝血系统和补体系统导致机体凝血、纤溶机制失衡,从而增加心血管事件的危险〔11〕。报道证实,hsCRP高浓度的患者将来发生心肌梗死或心脏致死的危险性超过正常人的3倍〔12〕。 联合监测ApoE基因频率和血清hsCRP浓度是目前进行CHD危险评估的最佳型〔13〕。本研究发现，对照组及CHD组ApoE各等位基因(ε2、ε3和ε4)之间的hsCRP含量没有明显差异，说明ApoE基因多态性与hsCRP含量没有直接关联，但两者均与CHD有直接关联。因此,联合监测ApoE基因多态性及血清hsCRP含量，对心血管疾病危险性的预测是一个具有新意和敏感的指标。

　　【参考文献】

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