Ras/Raf/MAPK信号通路与先天性心脏病发生学的研究进展

　　作者：束亚琴,莫绪明,杨中州　　作者单位：南京医科大学附属南京儿童医院心胸外科 国家遗传工程小鼠资源库暨南京大学模式动物研究所

　　【关键词】 Ras/Raf/MAPK 信号通路,先天性心脏病发生学

　　Ras/Raf/MAPK信号通路是细胞生物学中最具特征的通路，是膜受体信号向细胞内传递的重要途径，该通路参与调节细胞生长、凋亡和重要基因的表达。已经证实该通路成员的体细胞突变或者表达水平的改变与多种肿瘤的发病相关。近年来，研究发现该信号通路成员的生殖细胞突变影响胚胎发育，从而引起一些与先天性心脏病相关疾病有关的出生缺陷的发生。这类疾病主要包括努南综合征、手心颜面综合征、Costello综合征等。

　　1 Ras/Raf/MAPK信号通路

　　蛋白质的磷酸化与去磷酸化作为传递各种信息的信号转导机制，在细胞的生物学活动中发挥着重要的作用。一系列的蛋白激酶(protien kinase，PK)及其磷酸化构成了信号传导的生物学中最具特征的通路。此外，Ras/Raf/MAPK信号通路还与磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3kinase，PI3K)/PTEN/Akt通路及p53级联反应。Ras/Raf/MAPK信号通路是迄今为止研究最为活跃的通路之一，被认为是细胞通路等相互作用共同调节细胞生长和肿瘤生成。

　　2 胞外信号通过Ras/Raf/MAPK信号通路向细胞核内传递的过程

　　细胞外信号与膜受体结合后引起膜受体构象发生改变，从而结合一系列与Ras激活相关的蛋白(如Grb2、SOS等)，Ras被激活后进而以磷酸化的方式激活MAPK级联反应，实现了胞外信号向细胞核内的传递，同时激活胞内与细胞生长、分化等功能特异相关的基因。

　　2.1 受体二聚化及自身磷酸化 胞外生长因子与受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs)的胞外部分结合后，使受体构象发生改变，受体酪氨酸激酶活性增强，其自身的酪氨酸激酶结构域发生磷酸化。酪氨酸残基发生磷酸化后形成新的磷酸化位点，该位点可以和含有SH2结构域(即Src同源结构域2′Src homology domain 2)的蛋白特异性结合[1]。

　　2.2 募集接头蛋白Grb2 Grb2即生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor binding protein 2)，含有一个SH2结构域和两个SH3结构域,属SH蛋白;它作为接头蛋白可以和生长因子受体相结合[2]。

　　2.3 调控蛋白SOS的活化 SOS(son of sevenless)是一种Ras特异的鸟核苷酸交换因子(guanosine nucleotide exchange factors,GNEFs)，含有可与SH3结构域相结合的富含脯氨酸基序，SOS蛋白通过促进Ras蛋白进行GDP与 GTP的交换来激活RAS[3]。当Grb2结合到磷酸化的生长因子受体后，它的两个SH3结构域即可结合SOS，使之活化。

　　2.4 Ras的激活 Ras是一种鸟核苷酸结合蛋白(guanine nucleotidebinding proteins,GNBPs)，具有内源性GTP酶活性，包括KRas(A和B亚型)、NRas、HRas(1和2亚型)。Ras编码小GTP结合蛋白，参与很多细胞功能如细胞分化，细胞骨架形成及蛋白运输等[4]。作为一种分子开关，Ras具有活化的GTP结合状态(RasGTP)和失活的GDP结合状态(RasGDP)，这种激活过程是可逆的，膜受体(如EGFR、PDGFR)被细胞外信号激活后，在GNEFs的作用下，Ras的GDP被游离的GTP替代，Ras就被激活。继而Ras的分子开关发生构象变化并激活下游的分子如Ras，PI3K等。在内源性GTP酶的作用下，RasGTP被水解成RasGDP，Ras失活，对下游分子产生的活化信号即终止，该反应缓慢且不可逆，可以被GTP酶活化蛋白(GTPase activating proteins,GAPs)如神经纤维瘤蛋白(neurofibromin)、P120等加速，RasGTP可以在几分钟内被完全灭活[57]。

　　2.5 MAPK级联反应的激活 Ras进一步激活其下游分子Raf，从而激活了MAPK级联反应。Raf作为Ras下游的关键效应蛋白之一，是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，亚型包括：Raf1,ARaf和BRaf。Raf可以激活下游的MAPKK(MEK1/2)，进而激活MAPK(ERK1/2)，构成MAPK级联反应，MAPK激活后可以入核激活多种核转录因子和激酶，进而影响基因转录、调节细胞功能[89]。

　　此外，SHP2是近年来发现调节该通路的磷酸酶。SHP2(src homology region2，phosphatase2)是一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTPs),由PTPN11编码，PTPN11含有两个SH2(src homology docking)结构域：NSH2,CSH2，以及一个磷酸酶结构域(catalytic phosphatase PTPase)，SH2使其可以和磷酸化的酪氨酸位点结合。SHP2调节包括Ras在内的多条信号通路，对于Ras的完全激活是必要的。与一系列生长因子和细胞因子的信号转导相关，在细胞外信号向细胞核传递的过程中起重要作用，调节细胞增殖和分化。SHP2可以直接与生长因子受体作用，也可以与Grb2结合，使信号分子去磷酸化，对信号通路具有正向调节作用[10]。调节Ras活化的分子还有Gab1(multivalent Grb2associated docking protein Gab1)和PI3K等[11]。

　　一旦Ras/Raf/MAPK通路中的某一成员发生突变，就会引起通路下游效应蛋白的功能发生改变，通路保持持续激活状态，必然会引起细胞异常增殖以及凋亡障碍等，同时，该通路的过度激活还会影响Ras效应蛋白如PI3K及RalGEF等的功能[12]。

　　3 Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路的主要功能

　　RAS通路中Ras诱导Cyclin D1水平升高，参与调节细胞周期;参与创伤愈合及组织修复中炎性反应、细胞增殖、结缔组织形成、创面收缩与重组等多个过程;膜受体在没有外源生长因子刺激(不依赖配体)的情况下可以被整合素激活，进而使上皮细胞黏附到细胞外基质，从而触发一系列细胞活动，例如引起细胞增殖和肿瘤的发生。Ras通过调节与血管生成相关的基因(如血管内皮生长因子VEGF, 环氧合酶COX1/2, 血小板反应素TSP1/2, 尿激酶纤维蛋白溶酶原激活因子uPA以及基质金属蛋白酶MMP1/2等)的表达，来刺激血管内皮细胞并促进细胞外基质的重塑，从而引起内皮细胞的激活和迁移[1318]。因此，Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路参与了细胞生长、发育、增殖、分化以及细胞间功能同步等多种生理、病理过程。

　　4 与Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路相关的先天性心脏病及相关疾病

　　近年对动物模型及临床病例的研究发现，当Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路的基因突变发生在生殖细胞(Germline)中的时候将会影响胚胎发育，引起如心脏、骨骼、皮肤、神经等的异常。

　　与Ras/Raf/MEK/MAPK信号传导通路相关的先天性心脏病及相关疾病有努南综合征(noonan syndrome,NS)，Costello综合征(Costello syndrome,CS)，心颜面皮肤综合征(cardiofaciocutaneous,CFC)，LEOPARD综合征(LEOPARD syndrome,LS)，以上这些疾病既有共同的临床表现：心脏发育异常、不同程度的精神发育迟滞、身材矮小，也有各自相对特异的特征。这些疾病特征性的表型成为临床医生鉴别这类疾病的主要依据。

　　4.1 努南综合征

　　该病由美国儿科心脏病学家Noonan[19]于1963年首次描述，并以其名字命名。该病为常染色体显性遗传疾病，临床表现复杂，症状随着年龄的增长变得不显著，因此诊断就变得相对困难[20]。该病的发病率约为先天性心脏病的1/1500～1/2500[19，21]，是目前最常见的非染色体先天性心脏病综合征[22]。其主要表现为：先天性心脏病(瓣膜畸形、包括肺动脉狭窄、心肌肥厚、房室间隔缺损)，显著的面部畸形，蹼状颈，身材矮小，后发际低，轻度的精神发育迟滞，骨骼缺陷(胸廓畸形)，血液系统异常(JMML)等[20]。

　　努南综合征的发病与Ras/Raf/MEK/MAPK信号传导通路中的多个重要成员相关。

　　2001年Tartaglia报道了第1个努南综合征基因PTPN11，研究发现约有50%的努南综合征患者伴有PTPN11的错义突变[2324]。PTPN11全称ProteinTyrosine Phosphatase, Nonreceptor 11，其编码的蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosine phosphatase, SHP2)在包括MAPK通路在内的多条通路中起多种作用。目前在努南综合征患者中发现的突变主要位于NSH2以及PTP区域[2527]。Araki等[28]通过对PTPN11 D61G插入小鼠模型研究发现该模型的小鼠心内膜垫细胞的ERK1/2活性增强。纯合的D61G在胚胎期死亡，杂合的生存率降低。存活的Ptpn11(D61G/+)胚胎具有典型的努南综合征表型，如身材矮小、颅面畸形等;在死亡的Ptpn11(D61G/+)胚胎中，可见复杂的心脏缺陷(类似于RasGAPs-神经纤维蛋白缺乏的小鼠)，心内膜垫的ERK活性增强，同时证实这种ERK活性增强具有细胞以及通道的特异性。该模型也表明Ptpn11突变可以独立引起努南综合征的所有主要表型。Nakamura等[29]通过对αMHC Q79R SHP2和βMHC Q79R SHP2转基因小鼠模型的研究，发现该突变对于心脏发育的影响具有阶段特异性，即在不同的发育阶段有不同的作用。在胚胎期，SHP2Q79R突变选择性地激活ERK1/2通路，引起心脏结构异常(如心脏致密性降低，心室壁增厚，室间沟发育异常，最终引起房室扩张、血栓形成、水肿)，而在出生后，SHP2Q79R突变在心肌中的表达却是良性的。在心脏发育过程中，心肌细胞ERK1/2的过度激活对于心脏缺陷的形成是必需的，因为消除ERK1/2因素可以避免心肌缺陷的发生，形成正常的心脏结构和功能。Ferreira等[30]通过临床病例研究发现PTPN11相关的努南病例与肺动脉狭窄(pulmonary stenosis)的发病率具有相关性。

　　RAS是第2个被证实的NS基因，约5%的NS有KRAS的突变[31]。KRAS突变(如V14I、T58I、V152G、D153V)主要见于症状相对严重的NS病例，如NS/JMML患者特异的突变T58I[3233]。

　　到目前为止，在非PTPN11突变所致的努南综合征中，大约有20%伴有SOS1突变[34]。此外，还有研究者发现努南综合征伴有RAF1[34]和MEK1[35]。

　　4.2 心颜面皮肤综合征

　　该病呈散发，1986年由Reynolds等[36]首次报道，在表型上与努南综合征类似，患者主要表现为：精神发育迟滞，外胚层发育不良(头发稀疏卷曲，睫毛稀疏或缺失，皮肤干燥及角化)，肌张力减退及癫痫等[3638]。由于发病率极低，尚未有新生儿筛查或流行病学研究提供CFC确切的发病率。与CFC发病有关的基因主要有：BRAF：大约有半数以上的CFC有该基因突变，其中2/3患者有皮肤改变[32]。对于很多BRAF突变的功能性评估提示，该突变可以使激酶活性增强或减弱，这与肿瘤相关的BRAF突变类似。细胞培养提示BRAF突变引起MAPK ERK1/2的激活，以及转录因子ELK的激活。

　　有少数CFC病例有MEK1/2突变和KRAS突变[3941]，但是这类患者没有BRAF所致CFC患者典型的皮肤改变[32]。

　　CFC患者尚未有SOS1突变报道，且伴有SOS1突变的努南综合征患者表型与CFC差异很大，因此研究者认为SOS1几乎不可能与CFC发病相关[42]。

　　4.3 Costello综合征

　　Costello于1977年报道了两例病例，因此而命名[43]。该病呈散发，在表型上与努南综合征类似，区别在于Costello综合征伴有更严重的精神发育迟滞，更严重的面部畸形，口鼻部位乳头状瘤，皮肤松弛，对肿瘤有强烈的遗传倾向(主要是横纹肌肉瘤)[44]。此外，与NS和CFC患者不同的是，CS患者在婴儿期有明显的心律失常[43]。与Costello综合征发病相关的基因：

　　(1)HRAS：Gripp等[45]和Aoki等[46]发现大约90%的CS患者有HRAS的突变，这些突变之前都在不同的肿瘤中作为体细胞突变或致癌基因突变被报道，表明HRAS的生殖细胞突变不仅干扰发育过程，同时还增加机体对肿瘤的易感性。

　　(2)此外也有报道Costello 综合征患者有RAF、KRAS以及MEK的突变[41]。

　　以上3种疾病在临床表现上比较相似，分别有多个致病基因，尽管各自有相对特异的表型，但是有相当部分的复杂病例难以鉴别归类。

　　4.4 豹斑综合征

　　常染色体显性遗传疾病，是一种遗传性皮肤病合并肥厚性心脏病，患者在青春期出现多个着色斑[47]。PTPN11的生殖细胞突变除与努南综合征发病相关外，还会引起LEOPARD综合征，几乎所有的LEOPARD综合征患者都伴有PTPN11的突变[48]。此外，PTPN11的体细胞突变将会引起白血病的发生[49]。

　　4.5 多发性神经纤维瘤努南综合征

　　常染色体显性遗传疾病，发病率约为1/3000～4000。其发病与编码神经纤维瘤蛋白(neurofibromin)的基因有关，神经纤维瘤蛋白是GAPs的一种，加速RAS的活化过程，属于一种肿瘤抑制蛋白。该病主要特征是皮肤色素改变，多个部位神经纤维瘤的形成，如皮肤、皮下组织、颅神经以及脊柱神经等。具体临床表现随年龄和疾病严重程度各异[50]。此外，最近Brems等[51]报道在一例多发性神经纤维瘤样(NFlike)病例中发现SPRED1的生殖细胞突变(Germline lossoffunction mutations)，SPRED1是SPRY(SPROUTY)/SPRED家族成员之一，是RAS与RAF间作用及MAPK通路的负性调节蛋白，这是首次在人类疾病中发现SPRY(SPROUTY)/SPRED家族的突变。

　　对同时伴有NF和NS症状的患者，临床上将其命名为NFNS(neurofibromatosisnoonan syndrome)。Nava等[41]通过分析40例CFC、20例不伴有HRAS突变的CS、70例不伴有PTPN11及SOS1突变的NS，发现3种疾病患者均有BRAF、KRAS和MEK1突变，MEK2突变只见于CFC。通过对主要表型的分析提示CS和CFC临床表现有显著重叠。与MEK相关的表型相对较轻，并且有正常的精神发育。之前认为CS所特有的一些表型与BRAF和MEK突变相关。综上，研究者认为CS应仅用于已被证实有HRAS突变的患者;KRAS也是NS的一个主要致病基因，同时MEK也与一些NS相关，没有发现区别NS和CFC的简单原则[36]。

　　近期Gripp等[52]通过对一系列临床诊断为Costello综合征和诊断介于Costello综合征与CFC之间的病例进行突变基因和表型关系的研究，除HRAS以外还发现了BRAF和MEK的突变。在HRAS突变的患者中，羊水过多、生长激素缺乏及多个乳头状瘤更常见。在心脏表型(CHD,HCM,心动过速)方面也有一定差异，如CHD(特别是与房间孔未闭型缺损相关的肺动脉狭窄)多见于CFC，伴BRAF和MEK1突变的CFC患者房性心动过速发生率低于CS，多源性房性心动过速或紊乱性心房节律只在CS中发现;此外考虑到CS患者与肿瘤发病的密切关系，他们认为所有伴有KRAS和MEK均应该诊断为CFC，CS仅用于那些确认有HRAS突变的患者。

　　总之，努南综合征及努南相关疾病表型复杂，涉及全身多个器官和组织，致病基因多样化，因而就造成了临床诊断和疾病发病机制研究的困难。由于这些疾病均涉及Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路主要成员生殖细胞的突变，Bentires等[53]提出将以上一系列相关疾病统称为神经心颜面皮肤综合征(neurocardiofacialcutaneous,NCFC syndrome)。由于各个基因或同一基因的亚型可能会有不同的效应蛋白，或者在不同的组织或细胞表达有差异，以及信号通路之间的交互作用等，这就决定了这一类遗传性疾病的基因型和表现型的复杂性。相当数量散发病例的存在，表明有重要的突变尚未被发现。当然，除遗传因素以外，环境因素对疾病发生的重要作用不可忽视，例如母亲怀孕早期病毒感染、有毒化学物质污染等，因而要从更多层面进行更为深入的研究。

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