胆固醇吸收蛋白——降脂治疗的新靶点

　　作者：李辉,刘德平　　作者单位：卫生部北京医院心内科

　　【关键词】 胆固醇吸收蛋白,降脂

　　高胆固醇血症是动脉粥样硬化形成的重要危险因素，大量的临床实验证实，降低血胆固醇可以延缓动脉粥样硬化的进展，甚至逆转动脉粥样硬化。人体内胆固醇的来源主要通过自身细胞的合成和吸收膳食及胆汁中的胆固醇两个途径，胆固醇的清除主要通过合成胆汁酸和从胆汁排泄这两个途径。他汀类药物通过抑制3羟基3甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶的活性，减少体内胆固醇的合成，已经在临床实践中得到广泛的应用。胆固醇吸收抑制剂依折麦布(ezetimibe)则是通过抑制胆固醇的吸收发挥作用[1]。

　　2001年van Heek等[2]发现依折麦布可以选择性的抑制小肠上皮细胞对于胆固醇的吸收，但是对于脂溶性维生素、三酰甘油、胆汁酸的吸收没有影响。它可以抑制约50%通过饮食吸收的胆固醇，并使血LDL-C水平降低。

　　1 NPC1L1的发现和结构

　　2004年Altmann等[3]通过染色体生物信息系统证实了药物的分子学机制，其作用靶点是胆固醇吸收蛋白(NiemannPick C1like 1，NPC1L1)，它的氨基酸结构有42%与NiemannPick C1型蛋白 (NPC1)相同，这也是它名称的来源。NPC1蛋白是细胞内胆固醇转运的载体，是常染色体隐性遗传的致命性脂质沉积和神经变性NiemannPick病C1型的病因[4]。在人类和啮齿类动物，NPC1L1蛋白和mRNA主要表达在小肠和肝细胞内，在其他组织中几乎不表达或<10%小肠细胞的表达。小肠标本的免疫荧光染色显示，NPC1L1蛋白主要位于小肠细胞的刷状缘，在空肠近段的上皮细胞中含量最高[3,5]。电子免疫细胞化学显微镜检查显示，NPC1L1蛋白在细胞结构中主要位于微绒毛、溶酶体、内涵体和线粒体的膜上[4]。它在结构上具有13个跨细胞膜区域，并具有固醇感知区域[6]。

　　2 NPC1L1的功能

　　应用同源染色体重组技术制成NPC1L1基因敲除的小鼠(NPC1L1-/-)，给予放射标记的胆固醇饮食，肠道吸收的胆固醇较野生型小鼠(NPC1L1+/+)减少70%，减少程度等同于应用依折麦布治疗的野生型小鼠。NPC1L1-/-小鼠应用依折麦布后肠道胆固醇的吸收没有进一步减少，并且这种小鼠不会出现高胆固醇饮食导致高胆固醇血症的现象[3]。NPC1L1蛋白同样也是植物固醇吸收的转运载体，NPC1L1-/-小鼠植物固醇吸收同样减少，减少的量与NPC1L1+/+小鼠应用依折麦布后减少程度类似。应用依折麦布标记葡糖苷酸的技术显示，药物特异性地结合到NPC1L1+/+小鼠和人的小肠上皮细胞刷状缘，而在NPC1L1-/-小鼠没有显示药物的结合[7]。从而证实，NPC1L1蛋白是肠道依折麦布敏感的胆固醇和植物固醇吸收途径的转运载体。

　　在体外试验中也得到同样的结论，CaCo2细胞是人结肠癌上皮细胞，其标志酶的功能表达及通透特征与小肠上皮细胞类似，因而被大多数试验采用作为研究小肠上皮细胞转运和代谢的体外模型。应用RNA干扰技术敲除NPC1L1基因的CaCo2上皮细胞相对于正常对照的CaCo2上皮细胞，其胆固醇的摄取量减少30%以上[5]。应用转基因技术使CaCo2细胞高度表达NPC1L1蛋白后，对于培养基内的胆固醇的摄取明显增加。在培养基中加入药物依折麦布后，这些细胞对于胆固醇的摄取明显减少，并且随着药物浓度的升高，单位时间内胆固醇的摄取量逐渐降低[8]。

　　肝细胞也表达NPC1L1蛋白，通过转基因技术让小鼠肝细胞高度表达人NPC1L1蛋白时，胆汁内胆固醇的浓度降低至对照组野生型小鼠的10%～20%，但胆汁内磷脂和胆汁酸的浓度没有改变，同时血中的胆固醇浓度升高30%～60%。当这种小鼠应用依折麦布治疗时，胆汁和血中的胆固醇浓度恢复到正常对照小鼠的水平[9]。这表明肝细胞的NPC1L1蛋白调节胆汁中的胆固醇浓度，决定胆固醇在胆汁中的排出量，从而参与调节体内的胆固醇稳态，也是依折麦布的作用靶点。

　　3 NPC1L1活性的调节及其影响

　　NPC1L1蛋白的细胞表达和活性受到一些因素的调节，目前证实胆固醇浓度是最主要的调节因子。当食物中胆固醇含量高时，小鼠的小肠上皮细胞NPC1L1蛋白的表达较正常饮食的小鼠下调[10]。机制可能是通过细胞核的胆固醇感受器肝脏X受体(LXR)，其在调节细胞内胆固醇、脂肪酸、葡萄糖的动态平衡中发挥了重要作用，主要表达在肝脏、小肠、肾脏、脂肪等器官和组织。当细胞内胆固醇浓度升高时，LXR激活并导致小肠上皮细胞的NPC1L1 mRNA和蛋白表达下调[11，12]。CaCo2细胞应用洛伐他汀导致细胞内胆固醇水平降低时，通过激活甾醇调控元件结合蛋白2(SREBP2)，上调细胞NPC1L1 mRNA和蛋白的表达[13]。通过细胞内吞作用的循环途径，NPC1L1蛋白在细胞浆膜和细胞内结构间的分布可以转换。急性的胆固醇水平降低可以使更多的NPC1L蛋白分布到细胞膜上，形成突起的子区域，从而增加游离胆固醇的摄取[14]。

　　NPC1L1蛋白通过调节细胞内胆固醇的浓度，也调节其他基因的活性，来维持胆固醇在体内的动态平衡，如HMG-CoA还原酶、胆固醇酰基转移酶(ACAT)等。当小鼠NPC1L1基因敲除时，肝细胞和小肠上皮细胞中的胆固醇合成限速酶(HMG-CoA还原酶)活性增加。NPC1L1-/-小鼠肝细胞的HMG-CoA还原酶的基因表达是正常NPC1L1+/+小鼠的3.5倍，通过增加体内胆固醇的合成来代偿肠道吸收减少的胆固醇[15]。当人体接受依折麦布治疗时，肝脏和全身的胆固醇的合成同样也上调，因此在原发性高胆固醇血症单用依折麦布治疗时，血LDL-C仅降低18%，不能达到临床血脂治疗的目标。然而当依折麦布联合他汀类药物治疗时，通过两种降低胆固醇的机制协同发挥作用，使用起始剂量的他汀也可以使血中的LDL-C降低47%[16]，达到应用较大剂量他汀治疗的效果。

　　4 依折麦布的临床试验

　　由于依折麦布单药治疗降低LDLC效果有限，大多数临床试验采用联合治疗。在2型糖尿病合并高脂血症的患者中进行的VYTAL研究发现，依折麦布联合辛伐他汀较单用阿托伐他汀在降脂方面效果更明显，无论是LDLC、总胆固醇、非HDLC还是三酰甘油，联合治疗能更明显降低反映炎症的指标高敏C反应蛋白，同时有更多的患者可以达到美国的国家胆固醇教育计划成人治疗组第三次报告(NCEP ATPⅢ)制定的LDLC<1.82 mmol/L(70 mg/dl)的治疗目标，两组药物安全性方面是相似的[17]。针对慢性肾脏病的UKHARPⅡ研究发现，在20 mg辛伐他汀基础上加用依折麦布治疗6个月可以再降低LDLC达21%，但是临床事件的终点还在观察中[18]。针对家族性高胆固醇血症的ENHANCE研究显示，大剂量辛伐他汀联合依折麦布较单用辛伐他汀虽然有更显著的LDLC水平降低(56%比39%)，但是治疗1年后在减少颈动脉内中膜厚度和心血管事件方面没有明显差别，可能表明依折麦布没有增强消除动脉粥样硬化斑块的作用。依折麦布在降低血LDLC方面已经得到公认，但是目前改善临床预后的研究还很少，需要更多的研究来证实。

　　5 NPC1L1的遗传多态性

　　临床试验也发现，部分人群对于依折麦布的治疗没有反应，对他们进行染色体DNA的序列分析，证实其NPC1L1基因发生了某种程度的变异[19]。人类基因组研究也发现，NPC1L1基因有多个单核苷酸多态性(SNP)，具有不同单核苷酸多态性的人群，对于药物的反应也不一样，应用相同剂量的依折麦布血LDCC降低程度也不相同[20]。

　　6 前景展望

　　总而言之，随着NPC1L1蛋白研究的深入，人们对于胆固醇在体内的循环、代谢和保持动态平衡的机制得到了进一步的认识，并为治疗动脉粥样硬化药物的研发提供了新的作用靶点。依折麦布已经在临床上得到了广泛应用，在未来也许会有更多针对NPC1L1的药物问世，为动脉粥样硬化疾病提供更有效的治疗。

　　【参考文献】

　　[1]Van Heek M, France CF, Compton DS,et al.In vivo metabolismbased discovery of a potent cholesterol absorption inhibitor, SCH58235, in the rat and rhesus monkey through the identification of the active metabolites of SCH48461. J Pharmacol Exp Ther, 1997,283:157163.

　　[2]van Heek M, Compton DS, Davis HR.The cholesterol absorption inhibitor, ezetimibe, decreases dietinduced hypercholesterolemia in monkeys. Eur J Pharmacol,2001,415:7984.

　　[3]Altmann SW, Davis HR Jr, Zhu LJ,et al.NiemannPick C1 like 1 protein is critical for intestinal cholesterol absorption. Science,2004,303:12011204.

　　[4]Carstea ED, Morris JA, Coleman KG,et al.NiemannPick C1 disease gene: homology to mediators of cholesterol homeostasis. Science,1997,277:228231.

　　[5]Sané AT, Sinnett D, Delvin E,et al.Localization and role of NPC1L1 in cholesterol absorption in human intestine. J Lipid Res,2006,47: 21122120.

　　[6]Altmann, SW, Davis HR Jr, Zhu LJ,et al.NiemannPick C1 like 1 protein is critical for intestinal cholesterol absorption. Science,2004,303:12011204.

　　[7]GarciaCalvo M, Lisnock J, Bull HG,et al.The target of ezetimibe is NiemannPick C1like 1 (NPC1L1). Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102:81328137.

　　[8]Yamanashi Y,Takada T,Suzuki H. NiemannPick C1like 1 overexpression facilitates ezetimibesensitive cholesterol and betasitosterol uptake in CaCo2 cells. J Pharmacol Exp Ther,2007,320:559564.

　　[9]Temel RE, Tang W, Ma Y,et al.Hepatic NiemannPick C1like 1 regulates biliary cholesterol concentration and is a target of ezetimibe. J Clin Invest,2007,117:19681978.

　　[10]Repa JJ, Buhman KK, Farese RV Jr,et al. ACAT2 deficiency limits cholesterol absorption in the cholesterolfed mouse: impact on hepatic cholesterol homeostasis. Hepatology,2004,40:10881097.

　　[11]Repa JJ, Mangelsdorf DJ. The liver X receptor gene team: potential new players in atherosclerosis. Nat Med, 2002,8:12431248.

　　[12]Duval C, Touche V, Tailleux A,et al.NiemannPick C1 like 1 gene expression is downregulated by LXR activators in the intestine. Biochem Biophys Res Commun,2006,340:1259 1263.

　　[13]Horton JD, Goldstein JL, Brown MS.SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver.J Clin Invest, 2002,109: 11251131.

　　[14]Yu L, Bharadwaj S, Brown JM,et al.Cholesterolregulated translocation of NPC1L1 to the cell surface facilitates free cholesterol uptake. J Biol Chem, 2006,281: 66166624.

　　[15]Davis HR Jr, Zhu LJ, Hoos LM,et al.NiemannPick C1 like 1 (NPC1L1) is the intestinal phytosterol and cholesterol transporter and a key modulator of wholebody cholesterol homeostasis. J Biol Chem,2004,279:3358633592.

　　[16]Ballantyne CM, Abate N, Yuan Z, et al.Dosecomparison study of the combination of ezetimibe and simvastatin (Vytorin) versus atorvastatin in patients with hypercholesterolemia: the Vytorin Versus Atorvastatin (VYVA) study. Am Heart J,2005,149:464473.

　　[17]Goldberg RB, Guyton JR, Mazzone T,et al.Ezetimibe/simvastatin vs atorvastatin in patients with type 2 diabetes mellitus and hypercholesterolemia: the VYTAL study. Mayo Clin Proc,2006，81:15791588.

　　[18]Landray M, Baigent C, Leaper C,et al.The second United Kingdom Heart and Renal Protection (UKHARPⅡ) Study: a randomized controlled study of the biochemical safety and efficacy of adding ezetimibe to simvastatin as initial therapy among patients with CKD. Am J Kidney Dis,2006,47:385395.

　　[19]Wang J, Williams CM, Hegele RA. Compound heterozygosity for two nonsynonymous polymorphisms in NPC1L1 in a nonresponder to ezetimibe. Clin Genet,2005,67:175177.

　　[20]Hegele RA,Guy J, Ban MR,et al.NPC1L1 haplotype is associated with interindividual variation in plasma lowdensity lipoprotein response to ezetimibe. Lipids Health Dis,2005,4:16