靶向HPV18 E6基因不同锌指结构编码序列的siRNA对宫颈癌HeLa细胞作用的比较

　　作者：殷广洁,罗兵,王言奎　　作者单位：青岛大学医学院附属医院妇科，山东 青岛 266003; 青岛大学医学院微生物学教研室

　　【摘要】 目的 探讨靶向HPV18 E6基因不同锌指区编码序列的siRNA对HeLa细胞的影响。方法 分别设计靶向E6蛋白不同锌指区编码序列的两对siRNA，脂质体法转染HeLa细胞。半定量RTPCR检测E6 mRNA转录表达水平;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖活性;流式细胞仪Annexin VFITC/PI双染检测细胞凋亡情况。结果 与siRNASCR转染组比较，RTPCR结果显示，siRNA1和siRNA2转染后E6表达水平明显降低(F=8.709，P<0.05)， 且siRNA2组较siRNA1组下降更为显著(t=3.61，P<0.05)。MTT结果提示，2对siRNA转染后48 h和72 h的细胞增殖活性均明显下降(F=60.583、102.421，P<0.05)，siRNA2组较siRNA1组下降更为明显(t=4.717、7.932，P<0.01);2对siRNA转染后均未检测到明显的细胞凋亡。结论 靶向锌指2区编码序列的siRNA抑制E6基因表达和HeLa细胞增殖的效果更好，锌指2区可能是使HeLa细胞发生恶性转化并使其增殖失调控的关键区域。

　　【关键词】 RNA干扰 锌指 乳头状瘤病毒 人 E6基因 宫颈肿瘤 HeLa细胞

　　COMPARISON OF DIFFERENT siRNAS’ EFFECTS ON HeLa BY TARGETING TO 2 ZINCFINGER CODING REGIONS OF HPV18 E6 INDIVIDUALLY

　　YIN GUANGJIE, LUO BING, WANG YANKUI

　　(Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliate Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　[ABSTRACT] Objective To investigate the biological changes of HeLa cells after HPV18 E6 was knocked down at the coding regions of different zinc fingers. Methods The chemically synthetic siRNA targeting to HPV18 E6 was transfected into HeLa cells by Lipofectamine 2000, then the mRNA levels of HPV18 E6 were tested by RTPCR; MTT and flow cytometry used to detect proliferation and cell apoptosis,respectively. Results Compared with siRNASCR, the expression of E6 showed with RTPCR was significantly decreased after siRNA1 and siRNA2 transfection (F=8.709,P<0.05), with the decreasing more obvious in siRNA2 group (t=3.61,P<0.05). MTT results at 48 h and 72 h showed that both siRNA1 and siRNA2 could inhibit the proliferation of HeLa cells (F=60.583,102.421;P<0.05) with siRNA2 showing a more apparente effect (t=4.717,7.932;P<0.01). Flow cytometry revealed no significant apoptosis. Conclusion The siRNA targeting to the zinc finger Ⅱ more effectively inhibit the expression of E6 and the proliferation of HeLa cells. Maybe zinc finger Ⅱ is the key structure leading to the malignant transformation and outofcontrol proliferation of HeLa cells.

　　[KEY WORDS] RNA interference; Zinc fingers; Human papillomavirus 6; Uterine cervical neoplasms; HeLa cells

　　HPV (human papillomavirus)感染是公认的宫颈癌致病因子，其E6基因及其产物在诱导宫颈上皮细胞永生化过程中常常导致细胞基因失活、变异和异常表达，是其最主要癌蛋白编码基因。E6蛋白主要结构特征是含有2个锌指结构，其中锌指1区(zinc fingers1，简称ZF1)位于第30～66氨基酸，锌指2区(zinc fingers2，简称ZF2)位于第103～139氨基酸。关于E6蛋白两个锌指结构在体内的功能，迄今仍无确切的研究资料。本实验化学合成2对分别靶向HPV18 E6基因ZF1和ZF2编码序列的siRNA，检测其转染HPV18阳性人宫颈癌细胞系HeLa后对细胞增殖和凋亡的影响，旨在为优化E6基因siRNA选择标准提供实验室基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株 将HPV18阳性的人宫颈癌细胞系 HeLa常规培养于含体积分数0.10的胎牛血清、100 mg/L链霉素、100 kU/L青霉素的DMEM(购于GIBCO公司)培养液中，置于37 ℃，体积分数0.05的CO2饱和湿度的培养箱内培养。

　　1.1.2 试剂 LipofectamineTM 2000及TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;AMV逆转录试剂盒购自美国Promega公司;细胞凋亡检测试剂盒购自美国BECKMAN COULTERTM 公司。

　　1.2 siRNA设计合成

　　靶向HPV18 E6 ZF1和ZF2编码序列的2对siRNA，即siRNA1和siRNA2由广州锐博制药技术有限公司合成并行HPLC纯化。其中siRNA 1序列为：正义链(5′～3′)GACAGUAUUGGAACUUACA，反义链(3′～5′)CUGUCAUAACCUUGAAUGU，靶位点为HPV18 E6 108～126位碱基;siRNA 2序列为：正义链(5′～3′)ACGACGAUUUCACAACAUA，反义链(3′～5′)UGCUGCUAAAGUGUUGUAU，靶位点为HPV18 E6 372～390位碱基。同时设计合成阴性对照siRNASCR (错译siRNA，scramble siRNA)，序列为：正义链(5′～3′)GUACGCCAAAAGUUAAACC，反义链(3′～5′)CAUGCGGUUUUCAAUUUGG。该3对siRNA经BLAST同源性检索确认均与人类基因无明显同源性。

　　1.3 siRNA转染

　　根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南，采用通用型荧光标记的阴性对照siRNA进行转染条件的优化。取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞密度，接种于细胞培养板，用含体积分数0.10血清不含抗生素的DMEM培养，当细胞生长至60%～80%汇合时弃去旧的培养液，按照LipofectamineTM2000说明书进行转染。转染12 h后于荧光显微镜下观察转染效率，确定siRNA与LipofectamineTM2000最佳转染比例，然后按照此比例行实验组和对照组siRNA转染。

　　1.4 半定量RTPCR检测E6 mRNA表达水平

　　收集转染后48 h时的细胞，采用TRIzol一步法提取HeLa细胞总RNA，参照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PCR反应模板。PCR反应体系容量为25 μL，包括10×buffer 2. 5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 mmol/L，Taq 1 U，cDNA 3 μL，无菌去离子水补至25 μL。E6上游引物为5′CAACACGGCGACCCTACA3′，下游引物为5′GGATTCAACGGTTTCTGGC3′，扩增片段长度为140 bp;内参照GAPDH的上游引物为5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游引物为5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，扩增片段长度为452 bp。PCR反应条件为： 94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的18 g/L的琼脂糖凝胶中电泳30 min，使用凝胶自动成像系统分析各电泳条带吸光度(A)值。以E6/GAPDH的吸光度比值表示E6 mRNA的表达水平，检测siRNA作用后E6 mRNA表达水平变化。

　　1.5 MTT法检测HeLa细胞增殖情况

　　调整细胞浓度为6×107/L并接种至96孔细胞培养板，按照LipofectamineTM 2000说明书要求，以50 nmol/L终浓度转染3对siRNA，每组设立3个复孔。分别于转染后24、48和72 h向每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃继续孵育4 h，弃上清，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶充分溶解。用酶标仪于波长490 nm处读取其吸光度值，以此表示细胞增殖情况[1]。

　　1.6 Annexin VFITC/PI双染检测细胞凋亡

　　收集siRNA转染后72 h时的细胞，胰酶消化并充分吹打制备单细胞悬液。PBS调整固定细胞浓度为1×109/L，取1 mL细胞，在4 ℃条件下以1 000 r/min、离心10 min，弃上清。使用冰PBS洗细胞2次，并将细胞重悬于200 μL Binding Buffer。加入10 μL Annexin VFITC和5 μL PI，混匀后避光反应15 min，最后加入300 μL Binding Buffer，立即利用流式细胞仪检测凋亡细胞的百分率。同期设立siRNASCR转染对照，实验重复3次。

　　1.7 统计学分析

　　采用SPSS 11.5软件进行统计学处理，计量资料结果均以±s表示，并用方差分析或t检验进行比较。

　　2 结果

　　2.1 siRNA转染浓度选择

　　分别以10、20、50、80和100 nmol/L终浓度转染荧光标记的阴性对照，12 h后于荧光显微镜下观察。实验结果表明，50 nmol/L终浓度转染时细胞内荧光阳性率最高，转染效率约80%，因此实验中选择50 nmol/L作为siRNA转染浓度。

　　2.2 两对siRNA转染对HeLa细胞E6基因表达的影响比较

　　以50 nmol/L终浓度转染HeLa细胞，同期设立siRNASCR转染对照，用凝胶成像分析软件分析各组扩增条带的E6/GAPDH吸光度比值，结果显示，siRNASCR转染组E6/GAPDH比值为1.03±0.43，siRNA1和siRNA2转染后48 h时E6/GAPDH比值分别为0.45±0.12、0.16±0.07。siRNA1和siRNA2转染组与siRNASCR转染组比较，差异均有统计学意义(F=8.709，P<0.05)。siRNA1和siRNA2作用效果比较，以siRNA2转染组E6 mRNA表达下降更为明显(t=3.61，P<0.05)。siRNA转染后E6 mRNA表达RTPCR检测结果。

　　2.3 MTT法检测siRNA转染对HeLa细胞增殖的影响

　　不同时间点siRNASCR转染组和特异siRNA转染组HeLa细胞吸光度值。转染24 h时2对特异siRNA转染组的HeLa细胞的吸光度值与siRNASCR转染组相比较，差别无统计学意义(P>0.05);而48和72 h时2对特异siRNA转染后HeLa细胞吸光度值均明显下降(F=60.583、102.421,P<0.01)，siRNA2转染组较siRNA1组下降更为显著(t=4.717、7.932,P<0.01)。

　　2.4 siRNA转染对HeLa细胞凋亡的影响

　　采用流式细胞仪Annexin VFITC/PI双染检测细胞凋亡，结果显示，各组siRNA转染后均无明显细胞凋亡，代表细胞凋亡的右下象限内细胞比例差别没有统计学意义(P>0.05)。

　　①DNA marker，②siRNASCR组，③siRNA1组，④siRNA2组

　　A：siRNASCR转染组;B：siRNA1转染组;C：siRNA2转染组

　　3 讨论

　　HPV是无包膜的双链环状DNA病毒，其E6和E7基因在绝大多数宫颈癌组织中阳性表达，是公认的HPV主要致癌基因[2～5]。HPV早期编码区包含E1～E8等8个早期基因，其中E6及E7在细胞恶性转化中起关键作用。E7通过与Rb家族反应而使细胞周期失控，DNA大量合成，丧失DNA复制的保真度。E6则通过结合并降解p53，阻止DNA的修复或(和)阻止细胞进入程序性死亡[6,7]。

　　在HPV感染细胞中，E6蛋白定位于核基质及非核膜片段上。体外表达的E6 蛋白由157 个氨基酸残基组成, 主要结构是两个锌指结构, 每个锌指结构的基础是两个cys2x2x2cys，间隔29个氨基酸残基。一般根据功能不同将其结构分为5区：即C端(1～31aa)、锌指1区(32～68aa)、中央区(连接区69～104aa)、锌指2区(105～141aa)和C端(142～157aa)。研究结果显示，锌指1区和锌指2区都是病毒转化活性和引起蛋白反式激活所必需的，均与蛋白间的相互作用有关[8]。E6蛋白的N端主要与蛋白的稳定性有关，N端发生缺失突变会显著影响蛋白在体外的半衰期，而C端含有大多数的抗原表位。

　　本研究分别用2对靶向HPV18 E6基因ZF1和ZF2编码序列的siRNA转染HeLa细胞，结果表明，siRNA1和siRNA2转染后48 h时E6 mRNA表达水平均有下降，以siRNA2转染后下降更为显著。MTT检测结果显示，siRNA转染后细胞增殖活性降低，生长受到抑制，siRNA2转染对细胞增殖的抑制作用更强，提示ZF2与细胞的增殖活性关系更为密切，因此，我们推测E6蛋白的C端结构及ZF2是细胞发生恶性转化并使其增殖调控紊乱的关键区域。2对特异性siRNA转染后Annexin VFITC/PI双染均未检测到明显的凋亡，可能与未被完全沉默的极低水平E6也能保证细胞不发生凋亡有关。

　　关于siRNAs的设计ELBASHIR等[9]在2001年已提出比较具体的原则，但设计时往往要根据基因的不同区域，每个基因分别设计3～4组不同的siRNAs，从而验证不同的区域是否对siRNA介导的降解更为敏感，这样就造成了很大的浪费。本研究明确了分别靶向HPV18 E6基因ZF1和ZF2的2对siRNA转染对HeLa细胞生物学行为的作用差异，从而为优化靶向HPV18 E6基因的siRNA选择标准提供了实验室基础。

　　【参考文献】

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　　[8]KANDA T, WATANABE S, ZANMA S, et al. Human papillomavirus type16 E6 proteins with glycine substitution for cysteine in the metalbinding motif[J]. Virology, 1991,185(2):536543.

　　[9]ELBASHIR S M, HARBORTH J, LENDECKEL W, et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature, 2001,411：494498.