宫颈癌患者外周血及肿瘤组织中Th17/Th1细胞分布及意义

　　作者：付婷1,杨佩芳2,焦志军3　　作者单位：江苏大学 1.临床医学院; 2.附属医院妇产科， 3.附属医院检验科， 江苏 镇江 212001

　　【摘要】目的：探讨宫颈癌患者外周血、肿瘤局部组织中Th17、Th1细胞的分布特征及其在宫颈癌发病机制中的意义。方法：采用流式细胞术细胞内染色技术检测宫颈癌患者外周血、肿瘤组织标本和健康对照组外周血及子宫组织中Th17、Th1细胞;采用直线相关检验方法对Th17、Th1细胞进行相关性分析。结果：宫颈癌患者外周血、肿瘤组织中Th17细胞显著高于健康对照组(P<0.01)，外周血中Th1细胞显著低于健康对照组(P<0.01)，肿瘤组织中Th17、Th1细胞比例呈负相关。结论：宫颈癌患者局部肿瘤组织中存在Th17/Th1细胞失衡现象，这种失衡可能是宫颈癌发生发展的机制之一。

　　【关键词】 宫颈癌; Th17细胞; Th1细胞; 肿瘤

　　[Abstract]　Objective： To explore the distribution and significance of Th17 and Th1 cells in peripheral blood mononuclear cells and tumor tissue from patients with cervical caner. Methods： The frequency of Th17 and Th1 cells in peripheral blood mononuclear and tumor tissue from patients with cervical cancer and health people was determined by intracelluar staining with flow cytometry. The correlation between Th17 and Th1 was assessed by using bivariate correlation analysis. Results： The expression levels of Th17 and in patients was higher than control groups (P<0.01)， while Th1 levels was lower than controls (P<0.01). There was a negative correlation between Th17 and Th1 cells in tumor tissue from patients with cervical caner. Conclusion： There was an unbalance of Th17/Th1 cells in tumor tissue from cervical caner， which may be involved in the development of cervical cancer.

　　[Key words]　cervical caner; Th17 cells; Th1 cells; tumor

　　初始CD4+T细胞在体内不同的微环境下可分化为多种效应细胞，如Th1、Th2、Th17细胞等[1]。Th1细胞能够分泌细胞因子介导细胞免疫，发挥抗肿瘤免疫作用。在肿瘤患者体内，Thl/Th2细胞平衡呈Th2型偏移状态[2]。Th17细胞是近年来新发现的一类CD4+T细胞亚群，在机体炎性反应、自身免疫性疾病、肿瘤等的发生发展中发挥重要作用[3]。本研究以宫颈癌患者为研究对象，探讨Th17/Th1细胞是否与Th1/Th2细胞一样存在失衡现象。

　　1　对象与方法

　　1.1　对　象

　　标本来源于2009年1月至2010年7月江苏大学附属医院就诊的32例宫颈癌患者(平均年龄52±3.20岁)，外周血标本取自手术前，宫颈癌肿瘤组织标本取自手术、病理活检中。所有病例均经病理诊断证实且已确定病理分型、临床分期(FIGO)。根据宫颈癌FIGO分期将患者分为2组，早期宫颈癌组为第Ⅰ、Ⅱ期患者，共14例;晚期宫颈癌组为第Ⅲ、Ⅳ期患者，共18例。对照组外周血标本来源于同期在我院门诊体检的15例健康女性(平均年龄48±2.81岁);对照组的组织标本来自于无恶性病变行全子宫切除术的15例患者(平均年龄51±2.12岁)。所有研究对象均无类风湿、糖尿病、甲状腺功能亢进等自身免疫性疾病史，无传染病史以及免疫治疗史，宫颈癌患者术前均未接受过任何其他治疗。

　　1.2　主要试剂

　　PE标记的抗人IFN-γ、PE标记的抗人IL-17、APC标记的抗人CD3及PerCP-cy5.5标记的抗人CD8抗体(eBioscience公司);固定破膜试剂盒(Invitrogen公司);RPMI-1640培养基(Gibco公司);小牛血清(杭州四季青生物公司);佛波酯(PMA)、离子霉素(ionomycin，Ion)、莫能霉素(monesin)、Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶Ⅰ(Sigma公司)。

　　1.3　细胞分离

　　抽取宫颈癌患者及健康对照者静脉血，肝素抗凝，采用人淋巴细胞分离液(Ficoll)分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，分离的细胞以PBS洗涤重悬后备用。用PBS冲去宫颈组织上的血块并剔除坏死组织，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，经胶原酶、DNA酶Ⅰ、透明质酸酶消化后用200目钢网过滤，收集组织细胞悬液，用Ficoll分离并收集单个核细胞，PBS洗涤重悬后备用。

　　1.4　流式细胞检测

　　将从外周血及宫颈组织中分离出的单个核细胞经佛波酯、离子霉素、莫能霉素刺激5 h后，进行细胞表面分子的染色，通过固定透膜后再标记胞内抗体。采用BD FACSCalibur流式细胞仪进行检测。

　　1.5　统计学方法

　　流式细胞检测结果应用CellQuest软件分析，采用t检验分析PBMC及组织中Th1、Th17细胞的组间差异，宫颈癌患者PBMC及肿瘤组织中Th1、Th17细胞的相关性采用Pearson相关分析法，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结　果

　　2.1　宫颈癌患者PBMC中Th1、Th17细胞比例

　　采用流式细胞术分析32例宫颈癌患者及15例健康对照组PBMC中Th1、Th17细胞所占的比例，为了排除PMA对细胞表面CD4 抗原表达的影响，用CD3+CD8-设门表示CD4+T细胞。宫颈癌患者及健康对照组PBMC中Th1、Th17细胞流式细胞检测结果，Th1、Th17细胞比例。结果表明，宫颈癌患者PBMC中Th1细胞(CD3+CD8-IFN-γ+T细胞) 比例低于健康对照组，Th17细胞(CD3+CD8-IL-17+T细胞)比例高于健康对照组，差异均有统计学意义 (P<0.01)，提示宫颈癌患者的外周血中Th1细胞低表达，而Th17细胞明显增多。　宫颈癌患者及健康对照组外周血Th1、Th17细胞检测　　宫颈癌患者及健康对照标本中PBMC中Th1、Th17细胞比例

　　2.2　宫颈癌患者肿瘤组织中Th1、Th17细胞比例

　　检测宫颈癌患者肿瘤组织及健康对照组织中Th1及Th17细胞比例时，采用CD45+CD3+ CD8-设门表示CD4+T细胞，以减少组织细胞悬液中其他细胞的干扰。宫颈癌患者肿瘤组织中的Th1细胞比例与健康对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而宫颈癌患者肿瘤组织中的Th17细胞比例高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。提示宫颈癌患者肿瘤组织中Th17细胞呈优势表达。　宫颈癌患者肿瘤组织及健康对照标本中Th1、Th17细胞比例　宫颈癌患者肿瘤组织及健康对照组标本Th1、Th17细胞检测

　　2.3　宫颈癌患者Th17、Th1细胞相关性分析

　　宫颈癌患者PBMC中Th17、Th1细胞之间未见明显的相关性，但是在肿瘤组织中Th17和Th1细胞间呈明显的负相关(P<0.05)。进一步计算肿瘤组织中Th17/Th1的比值，结果表明，该比值在早期宫颈癌和晚期宫颈癌肿瘤组织之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。提示肿瘤组织中Th17、Th1细胞比例呈负相关，但在早、晚期疾病分期中没有区别，即与宫颈癌疾病进程无关。宫颈癌患者Th17、Th1细胞比例相关性分析　早期宫颈癌组及晚期宫颈癌肿瘤组织中Th17/Th1细胞比值的比较

　　3　讨　论

　　在初始CD4+T细胞分化过程中，Th1型细胞因子如IL-12、IFN-γ会活化信号转导和转录活化因子1(signal transducers and activators of transcription 1，STAT1)，从而抑制Th17细胞分化，并促进Th1细胞的存活与扩增;与Th17细胞分化相关的细胞因子TGF-β能抑制Thl型细胞的分化。Th17细胞不仅能产生IL-17，也能产生IFN-γ，提示Th17与Th1细胞之间存在相互转换的关系。已有文献报道，在多种人类肿瘤中存在着经典的Th1/Th2细胞漂移，且Th1/Th2细胞失衡现象与肿瘤的恶性程度呈正相关[4]。宫颈癌患者也存在着经典的Th1/Th2失衡，即在癌症患者体内存在着Th1细胞向Th2细胞漂移的现象，发挥抗肿瘤免疫效应的Th1细胞处于弱势地位而Th2细胞处于优势状态，从而促进机体恶性肿瘤增长，发生肿瘤逃逸[4]，且宫颈癌患者外周血中的Th1/Th2比值下降程度与临床分期相关[5-6]。Th17不仅在介导自身免疫性疾病中发挥着重要的作用，其与肿瘤的发生发展也存在着密切的关系[7-8]，Th17细胞已被证实在人类肝癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等多种恶性肿瘤患者中均有增多趋势[7,9-11]。但是，宫颈癌患者体内Th17/Th1细胞分布及相互之间平衡关系的研究尚未见报道。

　　本研究应用流式细胞术，检测了宫颈癌患者外周血及肿瘤组织中Th17、Th1细胞比例。结果显示，与健康对照组相比，宫颈癌患者外周血及肿瘤组织中Th17比例均明显增加，而对于Th1细胞而言，外周血中比例显著低于对照组，但在肿瘤组织中表达与对照组比较无明显差异。提示在宫颈癌的肿瘤微环境中，促进肿瘤进展的Th17细胞处于优势状态，能够发挥抗肿瘤免疫效应的Th1细胞则相对较弱。宫颈癌患者外周血及局部肿瘤组织中Th17细胞与Th1细胞呈现出不一致的分布格局。在肝癌患者的肿瘤组织中，Th17细胞表达水平明显高于癌旁组织，而Th1细胞未发现明显差异[9]，这与我们的实验结果一致。进一步分析宫颈癌患者外周血及肿瘤组织中Th17、Th1细胞的表达相关性发现，局部肿瘤组织中，Th17、Th1细胞表达呈负相关，即Th17细胞表达呈增多趋势，而Th1细胞表达下降，提示在宫颈癌患者肿瘤组织中，存在着Th17/Th1细胞失衡现象，Th17细胞较Th1细胞强势表达，说明抗肿瘤效应受到抑制，进而促进宫颈癌的发生发展。同时我们前期研究还发现宫颈癌患者存在Th17/Treg细胞失衡，Th17、Treg细胞在外周血及肿瘤组织中的表达均呈负相关，尤其早期宫颈癌患者体内Th17较Treg细胞强势表达，说明宫颈癌肿瘤微环境中Th17/Th1、Th17/Treg细胞平衡向着不同的方向发展，可能会导致不同的疾病结局。分析肿瘤组织中Th17/Th1细胞比值在早期及晚期宫颈癌组间的差异时并未发现有统计学意义，提示虽然在宫颈癌局部肿瘤组织中发现Th17/Th1细胞失衡现象，但与宫颈癌的疾病进展无关。基于此推测，宫颈癌肿瘤组织微环境更有利于Th17细胞分化，抑制Th1细胞，Th17/Th1细胞平衡关系也许可作为研究宫颈癌发病机制的指标之一。

　　综上所述，宫颈癌患者体内Th17细胞高表达，Th1细胞仅在外周血中低表达，且局部肿瘤组织中存在Th17/Th1细胞失衡现象，但与临床分期无关。但是在宫颈癌肿瘤微环境中有着极其复杂的免疫状态，它们之间存在着怎样的关系，是如何彼此影响，进而导致疾病向不同的结局发展还有待于我们进一步研究。

　　【参考文献】

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