MMP-9、p53在子宫内膜异位症组织中的表达及相关性研究

　　作者：乔海风，刘曼华，陶潜，杨其昌1，沈屹1 ，刘宏斌1 作者单位：(南通大学第二附属医院妇产科，1病理科，南通 226001)

　　【摘要】 目的：探讨肿瘤相关蛋白MMP-9、p53在子宫内膜异位症发生、发展中的作用。方法：应用免疫组化SP法检测30例异位子宫内膜、25例在位子宫内膜和30例正常子宫内膜及20例卵巢癌组织标本中MMP-9、p53蛋白的表达情况。结果：(1) MMP-9在子宫内膜异位症患者异位内膜中阳性表达率为86.7%，分别高于其在内异症在位内膜中的表达44%及正常子宫内膜中的表达16.7%(P<0.01)，而与其在卵巢癌组织中的表达90%差异无统计学意义(P>0.05);MMP-9在内异症在位内膜中的表达高于正常子宫内膜(P<0.05);(2)p53在子宫内膜异位症患者异位内膜中的阳性表达率为20%(6/30)，高于其在正常子宫内膜及内异症在位内膜中的阴性表达(P<0.05);p53在卵巢癌组织中的阳性表达率为50%(10/20)，显著高于异位内膜组织的表达(P<0.05);(3) Spearman 等级相关分析显示，MMP-9与p53在内异症异位子宫内膜中的表达无相关性(r=-0.294，P>0.05)。结论：MMP-9与p53可能通过各自不同的生物学途径参与了EMs的侵袭过程，两者在内异症的发生发展中发挥着重要作用。

　　【关键词】 MMP-9;p53;子宫内膜异位症;免疫组化

　　Study on the expression and their correlationship of MMP-9 and p53 in the tissues from endometriosis

　　LIU Manhua﹡ ,QIAO haifeng ,TAO Qian, et al. (Department of Obstetrics and Gynecology, Second Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To detect the role of MMP-9、p53 in the developement of endometriosis. Methods: Archived tissue samples of 30 ectopic, 25 eutopic,30 normal endometrium and 20 ovarian cancer were selected and immunohistochemically analyzed for MMP-9 and p53 expression. Results: ①The positive rate of MMP-9 in ectopic endometrium from endometriosis was 86.7%,higher than that in eutopic endometrium 44% and normal endometrium 16.7%(P<0.001), and the expression of MMP-9 in eutopic endometrium was higher than that in nomal endometrium(P<0.05),but there was no significantly difference between ectopic endometrium and ovarian cancer (P>0.05).②The positive rate of p53 in ectopic endometrium was 20%(6/30),higher than that in normal endometrium and eutopic endometrium from endometriosis(P<0.05), The expression of p53 in ovarian cancer was 50%(10/20),higher than that in endometriosis(P<0.05).③Through Spearman correlation test, there was no obvious correlation between MMP-9 and p53 in ectopic of endometriosis(r=-0.294，P>0.05). Conclusions: Both of MMP-9 and p53 may be involved in the invasion of EM through their respective moclear mechanism and may play an important role in the development of endometriosis.

　　[Key words] MMP-9;p53;Endometriosis;Immunohistochemistry子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs 简称内异症)是生育年龄妇女最常见的疾病之一。发病率为10%~15%，近年来有明显增高趋势[1]。其发病机制尚未完全阐明，组织学上虽然是良性病变，但却有增生、浸润、转移及复发等恶性生物学行为。近年来从恶性肿瘤发生的角度来探讨EMS 的发病机理已成为该疾病的研究热点。MMP-9 在肿瘤的侵袭和转移中倍受关注;p53基因是研究较为深入的抑癌基因，p53基因的突变或失活与多种肿瘤的发生密切相关。本研究采用免疫组织化学方法检测了正常子宫内膜、内异症异位内膜、在位内膜及卵巢癌组织中肿瘤相关蛋白MMP-9和p53的表达,以探讨肿瘤相关蛋白MMP-9和p53在内异症发生、发展中的作用及其在内异症组织中表达的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 选取2006年3月~2007年10月期间本院经病理检查确诊的卵巢子宫内膜异位症患者30例，年龄36~50岁，平均45岁，同时刮取在位内膜共25例;另取同期非子宫内膜异位症(并排除其它妇科疾病)的正常人自愿刮宫所取正常子宫内膜组织30例，年龄34~52岁，平均42岁;并选取2004年3月~2007年10月期间本院经病理检查确诊为上皮性卵巢癌患者的存档石蜡标本20例作为对照，年龄38~61岁，平均48岁。所有患者术前均无放疗、化疗史，术前3个月无甾体类激素治疗史。所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。

　　1.2 方法 免疫组织化学SP法：所有石蜡标本做4μm 连续切片,高压锅抗原修复, SP两步法、二氨基联苯胺(DAB)显色。MMP-9、p53 均为鼠抗人单克隆抗体、SP试剂盒和 DAB 显色液均购自福州迈新生物技术开发有限公司，严格按试剂盒说明操作。PBS替代一抗作为阴性对照, 以已知阳性片作为阳性对照。

　　1.3 结果判定 MMP-9阳性染色为细胞浆中出现棕黄色或褐色颗粒;突变型p53 效应产物为棕黄色颗粒,分布于细胞核;计数腺细胞或肿瘤细胞。显微镜下观察结果：根据细胞染色强度和染色细胞所占面积的得分之和进行评估,(1)染色强度评分标准:不着色为 0 分，黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，黄褐色为3 分;(2)染色细胞占整张片面积评分标准:无阳性细胞染色为 0分，≤25%为 1 分，26%~ 50%为 2 分，>50%为 3 分;(3)两种评分相加，0~1 分为(-)，2 分为弱阳性(+)，3~4 分为阳性(++)，5~6 分为强阳性(+++)。≤2 分的定为阴性，>2 分的定为阳性。

　　1.4 统计学处理 SPSS11.5统计软件，χ2检验或Fisher确切概率法及Spearman 等级相关进行分析，P<0.05示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MMP-9在正常子宫内膜、子宫内膜异位症在位内膜、异位内膜及卵巢癌组织中的表达 MMP-9在子宫内膜异位症患者异位内膜中阳性表达率为86.7%，分别高于其在内异症在位内膜中的表达44%(χ2=11.28,P<0.01)及正常子宫内膜中的表达16.7%(χ2=29.43, P<0.01);且在内异症在位内膜中的表达高于正常子宫内膜(χ2=4.94, P=0.02);MMP-9在卵巢癌组织中的阳性表达率为90%，与异位内膜组织的表达差异无统计学意义(χ2=0.13, P>0.05)，见表 1。

　　2.2 p53在正常子宫内膜、子宫内膜异位症在位内膜、异位内膜及卵巢癌组织中的表达p53 在正常子宫内膜及子宫内膜异位症患者在位内膜中均呈阴性表达;在子宫内膜异位症患者异位内膜中的阳性表达率为20%，表达水平显著高于正常子宫内膜及在位子宫内膜(χ2=4.630,P=0.024);p53在卵巢癌组织中的阳性表达率为50%，显著高于异位内膜组织的表达(χ2=4.963,P=0.026)，见表 2。

　　2.3 异位内膜组织中MMP-9与p53表达相关性分析 本研究显示，在30例异位内膜组织中，MMP-9和p53二者同时阳性表达4例;两者同时阴性表达2例;MMP-9(+)、p53(-)22例; MMP-9(-)、p53(+)2例。经Spearman 等级相关统计学分析表明：两者无相关性(r=-0.294，P>0.05)。见表 3。

　　3 讨 论

　　MMPs是一种锌离子依赖性的中性蛋白酶家族,参与降解ECM和基底膜的所有成分，在多数组织的降解和重建及疾病病理损害过程中起重要作用。子宫内膜细胞可周期性分泌MMPs，为正常子宫内膜的周期性脱落和重建提供必要的条件。MMP-9 是MMPs 家族中相对分子质量最大的明胶酶,能降解ECM中Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶等主要成分,并能促进血管内皮细胞生长,导致新生血管的形成,同时可通过与整合素的相互活化而加强细胞间的黏附作用[2，3]，从而可能在肿瘤生长、细胞迁移和血管生成中发挥着重要作用。Chung HW等[4]用PCR技术研究发现内异症患者异位内膜表达较高水平的MMP-9，MMP-9/TIMP3的比率较在位内膜及正常内膜高;Szamatowicz等[5]检测内异症不孕妇女腹腔液总MMP-9 浓度高于对照组,而活性MMP-9浓度与对照组无明显区别。本研究结果显示，MMP-9在内异症异位内膜的表达较在位内膜显著增高，这可能是由异位的子宫内膜细胞的异常分泌而致，从而使得异位内膜具有很强的蛋白水解能力, 导致腹膜及其他组织ECM的异常降解，穿透其周围的基底膜,而有利于异位内膜的侵袭和种植;另外，MMP-9尚有增加细胞的黏附及促血管生成的作用，促使异位内膜得以种植生长并不断扩大，促成内异症的发生、发展。本研究还显示，内异症在位内膜中MMP-9的表达高于正常子宫内膜，与Collette T等[6] 报道一致。提示内异症患者在位内膜较正常内膜有着更强的蛋白水解活性，更有利于其异位种植和黏附，促进内异症的发生。本研究比较了内异症异位内膜及卵巢癌组织中MMP-9的表达发现，差异无统计学意义，从另一个角度揭示出MMP-9可能以其独特的分子生物学机制参与了内异症的“恶性”生物学行为。

　　肿瘤抑制因子p53蛋白是人体内一个关键的细胞凋亡调节因子。野生型p53在细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA损伤、血管生成和转移的抑制以及其他功能方面发挥着重要作用。突变的p53基因则不仅失去对细胞生长的抑制作用，反而促进细胞转化和过度增殖，抑制细胞凋亡，使细胞的全部表型出现恶性化。正常p53蛋白生物伴随期短，20~30 min，不易在组织细胞中堆积，免疫组化法不能检测其存在，突变型p53蛋白生物伴随期延长，24 h左右，且稳定性增加，并可在组织细胞中堆积而过度表达，易被免疫组化法检测到[7]。可以认为，免疫组化学检测阳性即提示突变型p53的存在[8]。Bischoff FZ等[9] 用荧光原位杂交的方法研究发现，在严重的子宫内膜异位症中普遍存在 p53基因座的缺失，p53的体细胞突变参与了内异症的克隆演变过程。Gylfason JT等[10]定量分析美国及冰岛子宫内膜异位症病例p53DNA变化研究结果提示，体细胞p53基因座随机改变在发生重度子宫内膜异位症中起一定作用。本实验采用免疫组化SP法检测发现，p53在异位子宫内膜的阳性表达率为20%，显著高于在位子宫内膜及正常子宫内膜中的阴性表达。提示子宫内膜异位症异位内膜存在着突变型p53蛋白。当经血发生逆流后或逆流过程中，子宫内膜碎片中的p53由于种种原因发生了突变，其功能发生了相应的变化，丧失了其诱导凋亡的特性。也就是说，逆流的子宫内膜存在凋亡抑制，细胞周期调控机制发生了改变，从而使其得以异位存活种植，过度增生，促进内异症的发生发展。本研究还显示，p53在卵巢癌组织中的表达显著高于其在内异症异位内膜中的表达。研究证实，突变型P53能增强VEGF表达[11]，由于p53基因的突变而导致VEGF上升了4倍[12]。我们认为，p53可能通过凋亡抑制及促进血管形成的机制参与了内异症的发生发展过程，但又有别于卵巢癌。

　　总之，子宫内膜异位症是一种具有特殊生物学行为的良性疾病，其发生发展是一个涉及多基因、多因素、多步骤的复杂过程。本研究结果显示,MMP-9与p53在内异症异位内膜中的表达无明显相关性，提示MMP-9与p53可能通过各自不同的生物学途径参与了EMs的发生发展，深入研究这两个因子在子宫内膜异位症发生中的作用，对于进一步了解内异症的发病机制，指导临床治疗具有重要的意义

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