胎盘组织中Human AnnexinV的表达及与HBV感染的关系

　　作者：张润驹，岳亚飞，李淑红，石紫云，叶峰，归巧娣，石磊 　(西安交通大学医学院第一附属医院： 妇产科; 传染科，陕西西安 710061)

　　摘要：目的 观察Human AnnexinV(HAV)在胎盘组织中的表达，并探讨其在乙型肝炎病毒(HBV)感染胎盘中的可能作用。方法 用免疫荧光染色法检测早孕绒毛，中孕和足月胎盘绒毛中HAV的表达;用免疫荧光双重染色法观察HBV感染的胎盘组织HBsAg和HAV的分布及相互关系。结果 ①所有的标本绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、毛细血管内皮细胞都有HAV的存在。②HBV感染的胎盘绒毛中只要是HBsAg阳性的部位同时一定有HAV的表达，阳性信号存在于滋养层细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞中。结论 HAV可能作为HBsAg的特异性受体介导了HBV与胎盘组织各层细胞的粘附、内化等过程并最终导致了HBV对胎盘的感染。

　　关键词：胎盘;病毒受体;人膜联蛋白(HAV);乙型肝炎病毒(HBV)

　　Expression of Human Annexin V in placenta and its effects on placenta infected by HBV

　　Zhang Runju, Yue Yafei, Li Shuhong, Shi Ziyun, Ye Feng, Gui Qiaodi, Shi Lei

　　(Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital, Medical School

　　of Xian Jiaotong University, Xian 710061; Department of Infections Diseases, First Affilited Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the expression of Human Annexin V(HAV) in placenta and to explore the possible role of it in HBV infected placenta. Methods HAV was detected in placentas that had been proved infected with HBV with immunofluorescence assays and the doublelabel immunofluorescence assays were used to detect HBsAg and HAV in the same placenta. Confocal laser scanning microscope was also used to observe the result. Results ① HAV was expressed on early period, metaphase and term villi. It was expressed on trophoblastic cell, interstitial cell and endothelium cell of interstitial blood vessels of villi. The result had no relation with the infection of HBV and the time of pregnancy. ② The doublelabel immunofluorescence assays showed the positive area of HBsAg in placentas accorded with the area of HAV. Conclusion HAV mediated HBV into cells of placenta as specific receptor and resulted in infection.

　　KEY WORDS: placenta; viral receptor; human annexin V(HAV); hepatitis B virus(HBV)

　　我国为乙肝高感染区，HBsAg携带者高达1.2亿，其中50%以上为母婴传播所致。而HBV宫内感染是母婴传播的重要途径，感染率可高达40%以上[1]。目前普遍认为HBV宫内感染主要经胎盘感染而致，即孕妇绒毛间隙血中的HBV感染绒毛滋养层细胞、 绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞后感染胎儿[2]，但具体机理现仍不清楚。HBV感染肝脏的研究表明，HBV也同其他的病毒一样 ，首先通过病毒外膜蛋白识别肝脏细胞质膜上的受体[3]，和靶细胞上的受体结合，附着于细胞表面，在病毒受体的介导下，进入细胞进行复制。有研究发现人膜联蛋白V(Human Annexin V, HAV)是肝细胞膜上与HBV感染有关的受体[4]。并且在胎盘组织中也检测到HAV[5]，那么HBV感染胎盘各类细胞是否也与HAV有关?为此，我们对正常的不同孕期胎盘和足月HBV感染的胎盘中HAV及HBsAg表达应用免疫荧光双标记技术进行检测，以了解其分布和相互关系，并探讨HAV在HBV感染胎盘中的可能作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 2003年3月至2004年3月，收集在西安交通大学第一医院住院分娩的产前检查及复查血清中HBsAg阳性(其中大三阳12例，小三阳15例)孕妇足月分娩胎盘27例。同时随机收集3例HBV血清标志物阴性的正常足月胎盘;另外取人工流产及住院治疗性中期引产的HBV血清标志物阴性的孕妇绒毛和胎盘各3例。鼠抗人乙肝病毒表面抗原(HBsAg)单克隆抗体(一抗)、FITC标记兔抗山羊IgG(二抗)、罗丹明标记山羊抗小鼠IgG(二抗)购于北京中山生物技术有限公司。山羊抗人膜联蛋白V(Annexin V)多克隆抗体(一抗)，购于Santa Cruz 生物技术公司。

　　1.2 方法 取新鲜全层胎盘组织，大小为2cm×1cm×0.5cm，生理盐水洗去沾染的血液(末次洗后上清用PCR及ELISA未检测出HBV标志物)， 40g/L多聚甲醛固定24h;绒毛则直接用生理盐水冲洗后以40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片备用。

　　1.2.1 Human Annexin V免疫荧光染色 ①常规脱蜡至水;②H2O2 37℃ 15min封闭内源性过氧化物酶;③正常兔血清37℃ 30min封闭非特异性蛋白;④滴加1∶50稀释的山羊抗人膜联蛋白V多克隆抗体，4℃过夜;⑤滴加1∶100稀释的FITC标记的兔抗山羊IgG，37℃ 1h，以上各步间均用PBS冲洗，5min×3次;⑥缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)上观察并拍照。用于FITC的激发波长为495nm。用PBS取代山羊抗人膜联蛋白V多克隆抗体作为空白对照。

　　1.2.2 HBsAg和Human Annexin V免疫荧光双标染色 经SP免疫组化法检测出22例胎盘HBsAg阳性，用免疫荧光双标染色观察胎盘组织中HBsAg和Human Annexin V的分布。①切片常规脱蜡至水;②加入尿素，室温30min后，蒸馏水洗1次;③加1∶50稀释的鼠抗人乙肝病毒表面抗原单克隆抗体和1∶50稀释的山羊抗人膜联蛋白V多克隆抗体，4℃过夜;④滴加1∶100稀释的TRITC标记的山羊抗鼠IgG和1∶100稀释的FITC标记的兔抗山羊IgG，37℃ 1h;⑤无荧光缓冲甘油封片。以上各步间均为PBS洗5min×3次。在型号为LeiCaTCS SP2的激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)上观察并拍照。FITC的激发波长为495nm，TRITC的激发波长为546nm。

　　1.3 结果判断标准 HBsAg阳性部位发红色荧光，Human Annexin V阳性部位发绿色荧光，HBsAg和Human Annexin V的重叠处发黄色荧光。

　　2 结果

　　2.1 不同孕周胎盘Human Annexin V的表达和分布 应用免疫荧光染色方法检测血清HBsAg阴性早孕绒毛3例、中期引产胎盘3例、足月胎盘3例和血清HBsAg阳性的足月孕妇娩出的胎盘3例Human Annexin V的表达、分布。发现无论妊娠时间长短、感染HBV与否，所有标本的绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内血管内皮细胞都有Human Annexin V的表达(图1)。空白对照未显示阳性信号。

　　图1 免疫荧光染色绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内毛细血管内皮细胞HAV阳性表达呈绿色荧光(略)

　　Fig.1 Immunofluorescence staning of HAV in trophoblastic cells, villous mesenchymal cells and villous capillary endothelial cells, HAV positive is in green (10×40)

　　2.2 HBsAg和Human Annexin V在胎盘的分布 对HBsAg阳性的22例胎盘组织采用免疫荧光双标染色方法检测HBsAg和Human Annexin V在胎盘分布情况。发现胎盘绒毛中HBsAg、Human Annexin V和HBsAg+Human Annexin均有阳性表达，阳性信号存在于滋养层细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞(图2)。空白对照未显示阳性信号。

　　图2 免疫荧光双标染色检测绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内毛细血管内皮细胞HAV和HBsAg表达(略)

　　Fig.2 The detection of HAV and HBsAg in trophoblastic cells, villous mesenchymal cells and villous capillary endothelial cells by double labeling technique of immunofluorescence(10×40).

　　a: HAV positive is in green; b: HBsAg positive is in red, overlaped with HAV; c: HAV and HBsAg positive at the same site is in yellow

　　3 讨论

　　HBV属嗜肝病毒，但具有一定的泛嗜性，可感染多种组织，如心、肾等。已证实HBV与细胞膜上相应受体结合是其感染细胞的关键[3]，HAV是近年被作为HBV受体研究的热点之一。研究认为HAV可能作为HBV的细胞受体与病毒内吞及摄入直接相关[6]。并且多项研究显示HBV感染和复制仅发生于含HAV的组织和细胞中。体外实验中发现表达HAV的鼠肝细胞可特异性结合SHBsAg，并产生HBV复制性感染[7];不表达HAV的大鼠肝癌细胞FTO2B转染HAV基因后，能感染HBV，复制并表达HBsAg和HBcAg，且分泌HBVDNA至培养细胞上清中，使上清具有再感染能力[8]。也有研究证实在慢性肝炎患者各组织的HBVDNA、RNA转录体、抗原分布与HAV分布一致[9]。以上研究结果均说明HAV与HBV感染组织相关。虽然众多学者已证实HBV可感染胎盘各层细胞，但感染机制尚不明确。

　　本研究结果证实在不同孕期(早、中、晚期)、不同HBV感染状态(HBsAg阳性或阴性)的绒毛组织滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内毛细血管内皮细胞上均有HAV的表达。对HBsAg阳性胎盘的免疫荧光双重染色检测结果则显示胎盘绒毛组织中HBsAg和HAV的表达部位是一致的，它们的阳性信号出现在绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内血管内皮细胞。该结果进一步证实HAV可能作为HBsAg的特异性受体介导了HBV与胎盘各层细胞的粘附、内化等过程，并且在多种因素的参与下完成了病毒对胎盘的感染。但是HBV感染胎盘是一个复杂过程，可能涉及多种病毒吸附蛋白及多个靶细胞受体，并且还受到多种细胞内外因子的调节，因此，对HBV感染胎盘组织的确切机理还有待于更深一步的研究。

　　参考文献：

　　[1]Zhang SL, Han XB, Yue YF, et al. Relationship between HBV viremia level of pregnant women and intrauterine infection: neated PCR for detection of HBV DNA [J]. World J Gastroenterol, 1998, 4(1):6163.

　　[2]岳亚飞，姜秽，石磊,等. 乙型肝炎病毒宫内感染机理的研究 [J]. 中华妇产科杂志, 2004,39(4):224226.

　　[3]De Meyer S, Gong Z J, Suwandhi W, et al. Organ and species specificity of hepatitis B virus (HBV) infection:a review of literature with a special reference to preferential attachment of HBV to human hepatocytes [J]. J Viral Hepat, 1997,4(3):145153.

　　[4]Drust DS, Creutz CE. Differential subcellular distribution p36 (the heavy chain of calpactin) and other annexins in the adrenal medulla [J]. J Neurochem,1991,56:469478.

　　[5]Romisch J, Schuler E, Bastian B, et al. Annexin Ⅰ-Ⅵ: quantitative determination in different human cell types and in plasma after myocardial infarction [J]. Blood Coagul Fibrinolysis, 1992,3:1117.

　　[6]De Meyer S, Gong ZJ, Hertogs K, et al. Influence of the administration of human annexin V on in vitro binding of small hepatitis B surface antigen to human and to rat hepatocytes and on in vitro hepatitis B virus infection [J]. J Viral Hepat, 2000,7(2):104114.

　　[7]Hertogs K, Leeders WP, Depla E, et al. endonexin Ⅱ, present on human liver plasma membranes, is a specific binding protein of small hepatitis B virus (HBV) envelope protein [J]. Virology, 1993, 197(2):546557.

　　[8]De Meyer S, Depla E, Maertens G, et al. Characterization of small hepatitis B surface antigen epitopes involved in binding to human annexin V [J]. J Viral Hepat, 1999, 6(4):277285.

　　[9]De Bruin WC, Leenders WP, Moshage H, et al. Species specificity for HBsAg binding protein endonexinⅡ[J]. J Hepatol, 1996, 24(3):265270.