人类植入前胚胎抗ROS的机制研究进展

　　作者：邹宝林，于化州，李 强 ，胡淑敏，周玉言 作者单位：110043 辽宁沈阳，沈阳204医院生殖医学研究中心

　　【摘要】 ROS能够改变许多细胞的分子结构，也可引起人类植入前胚胎发育阻滞和坏死现象。人类胚胎中存在许多抗ROS的保护机制，而这些保护机制之间存在相互的协同作用。存在于卵泡和输卵管液中的外保护机制主要由非酶性抗氧化物组成，包括GSH、亚牛磺酸、牛磺酸、VC等;而存在于胚胎细胞内部的保护机制主要由SOD、GPX和谷氨酰胺半胱胺合成酶等，并且这些酶的转录密码子广泛存在于人类卵母细胞、胚胎和输卵管中。本文就人类植入前胚胎抗ROS机制作了一浅要的综述与探究。

　　【关键词】 人;植入前胚胎;ROS;机制

　　Research of defence mechanisms against reactive oxygen species in the preimplantation embryo of human

　　ZOU Baolin,YU Huazhou,LI Qiang,et al.Department of Reproductive Medicine Center,the 204 hospital of Shenyang,Liaoning Shenyang 110043，China

　　[Abstract] ROS can alter most types of cellular molecules,and also induce development block and retardation for human embryos.Multiple mechanisms of embryo protection against ROS exist,and these have complementary actions.External protection,present in follicular and tubal fluids,mainly comprises nonenzymatic antioxidants,such as hypotaurine,taurine and ascorbic acid; Internal protection present in embryo or oocytes,mainly comprises antioxidant enzymes: superoxide dismutase,glutathione peroxidase and glutamylcysteine synthetase.Transcripts encoding for these enzymes are present in the human oocyte,embryo and oviduct.In this paper,the defense mechanisms against ROS in human preimplantation embryos are simply reviewed and researched.

　　[Key words] human;preimplantation embryo;ROS;mechanism

　　目前，通过人类辅助生殖技术(IVF或ICSI)的产生的人类胚胎在体外培养环境中存在许多保护机制，而在母体内一般认为卵母细胞和胚胎是通过卵泡液和输卵管液中的氧清除因子来抵抗活性氧(ROS，Reactive oxygen species)的损伤。氧化损伤可能是由于在清除机制中产生过量的ROS或在一定程度上降低了清除ROS的效率，从而导致胚胎的发育受损。一般认为，胚胎或卵母细胞是通过三种方式来避免氧化效应：(1)阻止ROS的产生;(2)利用抗氧化剂拦截产生的ROS;(3)阻止ROS的自身修复。

　　Halliwell等[1]将抗氧化物定义为：任何一种物质，当相对于某种氧化底物以较低的浓度存在时，能够显著延滞或抑制该种底物的氧化作用，均可称之为抗氧化物。这种定义将抗氧化物扩大为非酶性抗氧化物和酶性抗氧化物。

　　1 非酶性抗氧化物抗ROS

　　许多化合物都有抗氧化功能，包括VA、VC和VE以及丙酮酸盐等。另外，一些硫化物如谷胱甘肽(GSH，Glutathione)、亚牛黄酸、牛磺酸和半胱胺(CSH，Cysteamine)等也具有很强的抗氧化作用。

　　1.1 GSH 谷胱甘肽(GSH)在人胚胎抗ROS效应中主要发挥非酶性保护作用。GSH在人卵母细胞和胚胎中主要起还原环境中的氧化物的作用，同时也充当抗氧化物酶--谷胱甘肽过氧化物酶(GPX，Glutathione peroxidase)的底物。Yoshida等[2]报道，人、猪卵母细胞中含有较高浓度的GSH。Takahashi等[3]认为人胚胎中的GSH高低与胚胎早期发育率和冷冻胚解冻存活率有很高的相关性，而Perreault等[4]研究证实仓鼠的成熟卵母细胞比未成熟卵母细胞中的GSH浓度要高，且在人类、猪和牛等动物的卵母细胞中GSH主要在卵母细胞成熟期间合成。De Matos等[5]报道，人类和牛卵母细胞中的GSH浓度的增加能使雄核染色体去浓缩从而利于雌雄原核的形成，同时也能使受精后的早期胚胎免于ROS的毒害，促使其发育至囊胚阶段。另外，Zuelke等[6]也报道猪和人类的卵丘细胞能够合成大量的GSH，而且无卵丘细胞的卵母细胞甚至能利用半胱氨酸直接合成GSH。Takahashi等[3]研究发现，人类早期胚胎中GSH合成受阻会导致胚胎中DNA的损伤，同时引起胚胎细胞中H2O2浓度增加，相应的在人IVF胚胎的培养液中添加GSH能显著提高胚胎的囊胚发育率。

　　1.2 CSH 半胱胺(CSH)能保护细胞免遭离子化辐射的毒害作用，被称为OH·的清除剂。已证实在人类、牛、猪、和羊的卵泡液中存在大量的CSH，CSH有助于维持卵母细胞中的氧化还原反应，并促使GSSG向GSH转化，以提高GSH/GSSG(还原型GSH/氧化型GSH)的比率，从而发挥抗氧化作用[7]。研究表明，CSH能提高人卵母细胞体外成熟和体外受精率，De Matos等[5]已证实，在人类或牛体外成熟液中添加一定浓度的CSH和半胱胺酸能促进GSH的合成，同时推测半胱胺酸可能也有助于维持卵母细胞中的内源性GSH池和CSH池的稳定。尽管De Matos等[5]认为在人类或牛的体外成熟液中添加CSH对胚胎后期发育有促进作用，但GuyaderJoly[8]则认为，在成熟液或体外培养液中添加CSH并不能促进IVF胚胎的进一步发育。

　　1.3 牛磺酸和亚牛磺酸 人类合子或胚胎中存在大量的由输卵管上皮细胞合成分泌的牛磺酸和亚牛黄酸。研究证实，亚牛黄酸能够中和OH·并能有效防止精子的脂质过氧化，即便在较低浓度的情况下，这种抗氧化作用仍然存在[9]。通过这种类似的方式，亚牛黄酸在生殖道液中对胚胎有很强的抗氧化作用。值得强调的是，亚牛黄酸在自由基清除后转化为牛磺酸，牛磺酸具有间接的抗氧化作用，它通过中和过氧化物级联反应的最终产物--细胞毒素乙醛，来限制ROS对胚胎或卵母细胞的毒害作用。Van Winkle等[10]研究表明人类胚胎能够摄取牛磺酸，即便牛磺酸的浓度在极低的条件下(一般0.3 μmol/L)仍对胚胎有保护作用。

　　另外，CSH、次牛磺酸和牛磺酸对合子或胚胎的保护作用存在连续的互补协同性。在人类胚胎体外培养液中添加亚牛磺酸均对胚胎的发育有积极作用，但对于牛磺酸，Devreker等[11]人则认为并不能显著促进胚胎体外发育。

　　1.4 维生素C 维生素C是一种潜在的直接抗氧化剂：借助于脱氧抗坏血酸，脂蛋白应急性的改变自身结构可提高细胞抗金属离子诱导的氧化作用。维生素C能够有效地阻止DNA内源性的氧化损伤[12]，在生理浓度的条件下，维生素C还可以刺激(诱导)输卵管上皮细胞释放亚牛磺酸和牛磺酸[13]。受精时存在于输卵管壶腹分泌部的分泌液是由输卵管分泌液和卵泡液的混合组成的，而这些分泌液中存在的大量的维生素C可以诱使女性在排卵时由输卵管上皮细胞释放牛磺酸和亚牛磺酸。尽管如此，在过渡金属存在的情况下，维生素C还有前氧化活性，可以促使Fe2+向Fe3+转化，因而能够催化Fenton反应：

　　Fe2++ H2O2→Fe3++ OH+OH· (Fenton反应)

　　1.5 其他维生素 VE是一种天然的抗氧化剂，有报道，VE的浓度与精子质量有很大的相关性，广泛存在于女性的卵巢和卵泡液中[14]。另外，VE还能够抑制NADPH氧化酶间接产生超氧负离子(O-·2)。因而，VE这一类脂溶性的抗氧化物在保护胚胎细胞膜免受氧化破坏的进程中有很大的促进作用。

　　1.6 丙酮酸 丙酮酸在人类早期胚胎或卵母细胞的能量代谢和氧化还原反应中发挥着很重的作用。目前已表明，丙酮酸可能有保护胚胎免遭氧化损伤的功能，ODonnellTormey等[15]认为由某些细胞分泌的丙酮酸，主要是作为胞外抗氧化剂。在人和牛早期胚胎体外培养过程中，胚胎细胞分泌的丙酮酸可有效防止过氧化引起的胚胎发育阻滞现象，当和乳酸一起添加到培养液中能明显阻止ROS的产生[16]。丙酮酸在H2O2存在时，发生脱羧反应生成乙酸、CO2和H2O，从而有效地阻止了H2O2对胚胎的毒害作用。

　　1.7 其他抗氧化复合物 转铁蛋白、球蛋白也是人类胚胎在体内发育时存在于环境中的抗氧化剂，转铁蛋白能中和Fe3+，而球蛋白能够通过捕获大量的类似脂质过氧化物的复合物来阻滞精子的脂质过氧化。这些不同的抗氧化物之间有着密切的联系[17]。例如：当细胞受到氧化损伤时，首先表现VE的不足，而后导致GSH的量明显降低，但是VE又可通过VC的消耗得到迅速的恢复。

　　2 酶性抗氧化保护剂抗ROS

　　2.1 抗氧化物酶的作用机理 一些抗氧化物酶通过SOD、过氧化氢酶或GPX来保护人类卵母细胞和胚胎免于遭受过氧化损伤。存在于胞液中的Cu、ZnSOD和位于线粒体中的MnSOD均能清除超氧化物自由基。所有的SOD在保护细胞免于氧自由基毒害作用的酶促过程中，主要起第一步酶催化作用，SOD催化超氧化物反应后生成的副产物--H2O2被胞液中的过氧化氢酶或GPX进一步催化清除。过氧化氢酶和GPX有直接或间接抗氧化作用，脂质中的过氧化物和H2O是通过GPX被还原的，而过氧化氢酶只能还原H2O2，这表明GPX在细胞抗氧化过程中有重要的作用。胚胎细胞中的谷胱甘肽还原酶(GR，Glutathione reductase)和谷氨酰胺半胱氨酸合成酶(GCS,Glutamyl cysteine synthetase)均能催化GSH的合成，从而维持细胞中一定浓度的GSH。Gardiner and Read等[18]报道，小鼠2细胞和囊胚阶段的早期胚胎中的GSH认为的诱使消耗后，在45 min之内能够自身恢复其原来的浓度，这表明GR在动物早期胚胎发育过程中有很重要的保护性作用。

　　已证实在所有哺乳动物的成熟卵母细胞中均存在Cu、ZnSOD的转录密码子，特别是人卵母细胞[19]，这进一步表明在胚胎的早期发育过程中，Cu,ZnSOD 发挥着很关键的抗氧化作用。人类和小鼠的卵母细胞在GV和MⅡ期时，Cu,ZnSOD和GCS的转录本有较高的表达，GPX和MnSOD转录本在人类及小鼠MⅡ期卵母细胞中也被检测到了，这说明在调控这些转录本表达的过程中可能存在重腺苷酰化作用。BreviniGandolfi等[20]已经在人类卵母细胞中发现了调控进一步表达/转录RNA多腺苷酰化的最后修饰片断。

　　过氧化氢酶转录本在小鼠MⅡ期卵母细胞中不存在，却广泛存在于囊胚中[19]，这表明，过氧化氢酶对小鼠卵母细胞的抗氧化作用可能是在形成合子之后才有效的。而在人的输卵管液中的过氧化氢酶的活力很高，而且过氧化氢酶能够直接结合在精子上，以抵抗女性生殖道中的氧化作用，增加精子的存活率和受精率[21]。

　　2.2 抗氧化物酶的基因调控 mRNA、蛋白质、酶活水平之间的相互密切联系表明，抗氧化物酶(SOD、过氧化氢酶、GPX)是在翻译之前被调控的，这样，所检测到的转录本可能已被翻译并生成了有活性的酶。这些结果表明人类胚胎的抗ROS作用机理部分取决于卵母细胞发生期间作为mRNA储存的内源性抗氧化物酶池。母源性转录本的总量在胚胎发育过程中逐渐减少，在卵母细胞成熟期间，抗氧化物酶母源性mRNA和成活累积的变化可能会直接影响胚胎的体外发育，当低于某一阈值即可能导致胚胎发育阻滞或闭锁[7]。

　　许多基因表达是通过ROS上行或下行调控的，抗氧化物酶基因的表达也是由氧压刺激来调控的，胞内氧化还原反应电位能够调控一些转录因子的活性，通过这种途径ROS可以激活某些抗氧化物的保护基因。人和鼠的抗氧化物酶的不同基因表达模式，反应了它们的胚胎在体内和体外发育率的差异性。小鼠卵母细胞和胚胎中的抗氧化物酶转录本编码较人类完整，相应的其胚胎在体外的发育率也较高。

　　2.3 抗氧化物酶与ROS的互作 胞内的氧化还原反应也能够调节抗氧化物转录子的活性。不适宜的胚胎培养条件可以导致胚胎代谢机制的改变而产生ROS，进而反过来影响抗氧化物酶基因的表达。一般的，这些抗氧化保护体系之间是通过互补协同作用来到保护人类胚胎不受ROS损害的。胚胎氧化反应产生的金属触媒被存在于其环境中的金属鳌合物(转铁蛋白、球蛋白)除去，胚胎中SOD、GPX和过氧化氢酶在清除胞内的超氧化物和过氧化物之后重新与金属触媒反应以形成更多的活性物。最后，未被酶性抗氧化物(GSH、VC、VE和亚牛黄酸)降解的过氧化反应链被ROS启动，继续分解ROS。但尽管有这些机制的存在，当过氧化损伤发生时，过氧化反应的最终产物--细胞毒素乙醛被一些硫化物(如牛黄酸等)中和而降解。因而，在胚胎及其环境中似乎存在着多重互补保护机制。

　　3 其他抗氧化机制

　　在人类植入前胚胎中还存在另一潜在的抗氧化机制，该机制主要发挥自身的代谢作用。这就是说，在人类早期胚胎代谢过程中的ATP大部分来源于糖酵解，而只有少于30%的ATP是由氧化磷酸化产生的，这表明人类早期胚胎在整个代谢过程中主要是通过厌氧反应进行代谢的，这一代谢机制有助于减少胚胎线粒体产生ROS，从而减少氧化损伤的危害。

　　4 小结

　　正常情况下人类胚胎代谢产生ROS后，胚胎过程中产生ROS后，胚胎自身能立即启动保护机制以抵抗ROS给胚胎带来的毒害作用，在胚胎发育过程中，特别是体外受精胚发育进程中，ROS必须连续不断地被灭活，这就是为什么胚胎中的抗ROS机制本质上是多元互作的且看起来似乎是冗赘的。一般认为，在生理条件下，胚胎或卵母细胞是通过内部保护体系和存在于输卵管环境中的外保护体系来阻止ROS的产生和修复的。已证实，外保护机制是通过抗氧化物来实现的，而人类胚胎内保护机制主要是由抗氧化物酶发挥作用的，研究表明这些酶的转录密码子储存在卵母细胞成熟阶段，而这些密码子的储存量直接影响卵母细胞受精后体外发育状况。体外培养人卵母细胞或胚胎，由于培养环境不能完全模拟女性生殖道以及体外操作(特别是卵胞浆内单精子显微注射)的影响，易于产生大量的ROS而对卵母细胞成熟或胚胎的发育不利。因而，研究人类植入前胚胎的培养条件，探寻胚胎抗ROS的机制，对人类辅助生殖技术、攻克不孕不育症等生物模式的治疗手段的发展有着相当深远的积极作用。

　　【参考文献】

　　1 Halliwell B,Gutteridge J M C.The chemistry of oxygen radicals and other derived species.In: Halliwell B and Gutteridge J M C(eds).Free Radicals in Biology and Medicine.2nd edn.Clarendon Press,Oxford,1998,2285.

　　2 Yoshida M,Ishigaki K,Nagai T,et al.Glutathione concentration during maturation and after fertilization in pig oocytes: relevance of the ability of oocytes to form male pronucleus.Biol Reprod,1993,49:8994.

　　3 Takahashi M,Nagai T,Hamano S,et al.Effect of thiol compounds on in vitro development and intracellular glutathione content of bovine embryos.Biol Reprod,1993,49:228232.

　　4 Perreault SD,Barbee RR and Slott VI.Importance of glutathione in the acquisition and maintenance of sperm nuclear decondensing activity in maturing hamster oocytes.Dev Biol,1988,125:181186.

　　5 de Matos DG,Furnus CC,Moses DF,et al.Effect of cysteamine on glutathione(GSH) level and development capacity of bovine oocytes maturated in vitro.Mol Reprod,1995,42:432436.

　　6 Zuelke KA,and Perreault SD.Hamster oocyte and cumulus cell glutathione concentrations increase rapidly during in vitro meiotic maturation.Biol Reprod,1994,50(suppl),144(abstract).

　　7 Guerin P,Mouatassim S EI and Menezo Y.Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the preimplantation embryo and its surroundings.Hum Reprod,2001,vol7,No2:175189.

　　8 GuyaderJoly C,Guerin P,Renard JP,et al.Precursors of taurine in female genital tract of mammals: effects on gametes and embryo.Amino Acids,1998,15:2742.

　　9 Aruoma OI,Halliwell B,Hoey BM,et al.The antioxidant action of taurine,hypotaurine and their metabolic precursors.Biochem J,1988,256:251255.

　　10 Van Winkle L J and Dickinson H R.Differences in amino acid content of preimplantation mouse embryos that develop in vitro vs in vivo.In vitro effects of 5 animo acids that are abundant in oviductal secretions.Biol Reprod,1995,52:96104.

　　11 Devreker F and Hardy K.Effects of glutamine and taurine on preimplantation development and cleavage of mouse embryo in vitro.Biol Reprod,1997,57:921928.

　　12 Fraga CG,Motchnik PA,Shigenaga MK,et al.Ascorbic acid protects against endogenous oxidative DNA damage in human sperm.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:1100311006.

　　13 Guerin P,Guillaud J and Menezo Y.Hypotaurine in spermatozoa and genital secretions and its production by oviduct epithelial cells in vitro.Hum Reprod,1995,10:866872.

　　14 Cerolini S,Kelso KA,Noble RC,et al.Relationship between spermatozoa lipid composition and fertility during aging in the chickens.Biol Reprod,1997,57:976980.

　　15 ODonnellTormey J,Nathan CF,Lanks K,et al.secretion of pyruvate: an antioxidant defense of mammalian cells.J Exp Med,1987,165:500514.

　　16 Morales H,Tilquin P,Rees JF,et al.Pyruvate prevents peroxide induced injury of in vitro preimplantation human embryos.Mol Reprod Dev,1999,52:149157.

　　17 Pascoe GA,Fariss MW,Olafsdottir K,et al.A role of vitamin E in protection against cell injury: maintenance of intracellular glutathione precursors and biosynthesis.Eur J Biochem,1987,166:241246.

　　18 Gardiner CS and Reed DJ.Glutathione redox cycledriven recovery of reduces glutathione after oxidation by tertiarybutyl hydroperoxide in preImplantation mouse embryos.Arch Biochem Biophys,1995,321:612.

　　19 EI Mouatassim S,Guerin P and Menezo Y.Expression of gene encoding antioxidant enzymes in human and mouse oocytes during the final stages of maturation.Mol Hum Reprod,1999,5:720725.

　　20 BreviniGandolfi TA,Favetta LA and Muri L.Changes in poly(A) tail length of material transcripts during in vitro maturation of bovine oocytes and their relation with developmental competence.Mol Reprod Dev,1999,52:427433.

　　21 Lapointe S,Sullivan R and Sirard MA.Binding of a bovine oviductal fluid catalase to mammalian spermatozoa.Biol Reprod,1998,58:747753.