chk2反义寡核苷酸对顺铂作用下HeLa细胞凋亡的影响

　　作者：朱克修，王佳，李玢，曹亚莉，韩晓兵 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 观察宫颈癌HeLa细胞转染chk2反义寡核苷酸后，在顺铂作用下对凋亡的影响。方法 采用MTT法检测不同浓度顺铂作用人宫颈癌细胞株HeLa 24、48、72 h后对细胞的生长抑制率。以脂质体为载体将chk2正义链和反义链转染HeLa细胞，用Western blot 检测HeLa细胞中Chk2蛋白的表达，用流式细胞仪和TUNEL法检测顺铂作用后细胞凋亡率。结果 顺铂对HeLa细胞有生长抑制作用，并有时间和浓度依赖性;反义chk2转染后可明显抑制Chk2蛋白表达(P<0.01)，顺铂作用下细胞凋亡率明显高于转染正义链组(P<0.01)。结论 反义寡核苷酸封闭chk2基因可增加HeLa细胞对顺铂的凋亡敏感性。

　　【关键词】 chk2基因;反义核酸技术;宫颈癌;顺铂

　　Influence of antisense oligodeoxynucleotide targeting chk2　on apoptosis of HeLa cells induced by DDP

　　Zhu Kexiu, Wang Jia, Li Fen, Cao Yali, Han Xiaobing

　　Department of Obstetrics & Gynecology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the change of antisense oligodeoxynucleotide targeting chk2 apoptosis in cervical cancer cells HeLa induced by cisplastin (DDP). Methods The proliferation-inhibiting rates of HeLa cells induced by DDP in different concentration were measured by MTT assays. Oligonucleotide was transfected into HeLa cells by liposome. The expression of Chk2 was observed by Western blot. The apoptosis rate of HeLa cells induced by DDP was investigated by flow cytometer and TUNEL. Results The growth inhibition rate of HeLa cells increased gradually, which was dependent on the dosage of DDP and the action time. Transfection with antisense oligonuleotide targeting chk2 could inhibit the expression of Chk2 protein (P<0.01), and the apoptosis rate was significantly higher than that of the sense blocking (P<0.01). Conclusion Antisense blocking of chk2 could increase the apoptotic sensitivity of HeLa cells to DDP.

　　KEY WORDS: chk2 gene; antisense nucleic acid technology; cervical cancer; cisplastin (DDP)

　　宫颈癌是世界范围内女性第二大恶性肿瘤。近年来,随着肿瘤化学治疗的基础与临床研究的迅速发展,化疗药物的不断开发及给药途径和方法的改进,以顺铂(cisplatin, DDP)为核心的联合化疗在宫颈癌治疗中取得了一定进展，然而肿瘤细胞的多耐药性成为肿瘤化疗失败的重要原因。肿瘤细胞逃避凋亡是宫颈癌化疗耐药的一个重要因素，放、化疗作用下肿瘤细胞周期检查点激活，导致细胞周期阻滞和细胞的损伤修复，而使细胞避免凋亡。目前研究认为细胞周期检测点途径主要由ATM(ataxia telangiectasia mutant)、ATR-Chk1/2-Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C轴组成[1]。细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2, Chk2)属于丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞周期检测中最关键的效应蛋白激酶[2]。因此，以chk2为作用靶点,干扰细胞损伤修复机制,提高肿瘤治疗的敏感性可能成为一种有效的治疗选择。本研究通过检测chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导的HeLa细胞凋亡的影响，探讨chk2能否作为宫颈癌增敏治疗的有效靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人宫颈癌HeLa细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院临床研究医学分子中心提供，在37 ℃，50 mL/L的CO2条件下用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。RPMI 1640购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。MTT购自Amressco公司，转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。鼠抗人Chk2单克隆抗体购自Neomarkers公司，辣根酶标记的羊抗鼠抗体购自博士德公司，ECL购自Amersham Bioscience公司。AnnexinV-FITC试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物公司。

　　1.2 MTT法检测顺铂(DDP)对细胞的生长抑制率

　　取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞浓度5×104/mL，接种于96孔板，200 μL/孔，培养24 h后加药，使顺铂终浓度为10、20、40、80、160 μmol/L，每个浓度设四个平行孔，并同时设不加药物的阴性对照和无细胞的空白对照，分别于作用24、48、72 h后加入5 g/L的MTT溶液，20 μL/孔，继续培养4 h后，吸去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)，150 μL/孔，振荡器震荡10 min，使结晶溶解完全，用酶标仪在490 nm处测量吸光度A值，计算细胞增殖抑制率(inhibition rate, IR%)。以浓度为横轴，细胞生长抑制率为纵轴绘制在不同时间点不同浓度顺铂对HeLa细胞的生长抑制曲线。

　　1.3 寡核苷酸的转染

　　1.3.1 寡核苷酸的合成

　　chk2反义寡核苷酸序列参考文献[3-4]，由上海生工生物技术服务有限公司合成，序列为：chk2反义链：5′-TCCACAGGCACCACTTCC-3′;正义链：5′-GGAAGTGGTGCCTGTGGA-3′,采用全硫代修饰，部分寡核苷酸链的5′端以FITC标记。

　　1.3.2 最佳转染条件的确定和转染效率的检测

　　严格按照Lipofectamine 2000试剂说明书进行转染，具体如下：于转染前一天用无抗生素的含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640调整细胞浓度为2.5×105/mL，接种于24孔板，500 μL/孔。转染当天细胞密度达到90%-95%，并换为500 μL无抗生素无血清RPMI-1640。分别取不同量的荧光标记的寡核苷酸链(0.6、0.8、1.0 μg)加到50 μL的RPMI-1640中，混匀。再取2 μL的Lipofectamine 2000，加到50 μL的RPMI-1640中，混匀。室温放置5 min后，将分别混有寡核苷酸链和Lipofectamine2000的RPMI-1640混合，室温放置20 min(寡核苷酸链与脂质体比值分别为0.3、0.4、0.5 μg/μL)。将上述混合物加入24孔板中，轻轻混匀，培养6 h后将培养基换为500 μL含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640，继续培养至24 h，荧光倒置显微镜下观察转染效率。

　　1.3.3 Western blot法检测HeLa细胞转染前、后Chk2蛋白表达

　　裂解细胞提取总蛋白，按Bradford法进行蛋白定量，煮沸5 min使蛋白变性，12 g/L的SDS-PAGE电泳分离后，湿转到硝酸纤维素膜上，将膜置于50 g/L脱脂奶粉中室温封闭1 h，以鼠抗人的Chk2单克隆抗体按1∶400室温孵育1.5 h，用TBST洗膜6次，每次3 min，再与辣根酶标记的羊抗鼠二抗1∶500室温孵育1 h，TBST洗膜6次，每次3 min，以ECL显色，X光胶片曝光，洗片。用凝胶成像系统检测蛋白表达灰度值。

　　1.4 实验分组

　　共分5组：正常组(normal group)，细胞未经任何处理;顺铂组(DDP group)，20 μmol/L顺铂处理24 h;空脂质体组(empty lipoplast group);转染chk2正义链组(Chk2 positive-sense oligonucleotides group, Chk2 ond group);转染chk2反义链组(Chk2 antisense oligonucleotides group, Chk2 Asodn group)。后三组按前述方法转染完成后用20 μmol/L顺铂处理24 h。

　　1.5 细胞凋亡的检测

　　1.5.1 采用Annexin Ⅴ-FITC试剂盒检测细胞凋亡

　　收集细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，取1 mL细胞，PBS洗涤后将细胞悬于200 μL Binding buffer，加10 μL Annexin V-FITC，混匀，室温避光孵育15 min，再加入300 μL Binding buffer和5 μL碘化丙啶(PI)，流式细胞仪检测。

　　1.5.2 TUNEL法检测细胞凋亡

　　将HeLa单细胞悬液接种于预置盖玻片的24孔培养板培养，按上述分组处理细胞后取出盖玻片，多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒说明进行操作。

　　1.6 统计学分析

　　重复3次实验，结果采用SPSS13.0统计软件进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 顺铂对HeLa细胞的生长抑制作用

　　阴性对照组HeLa细胞生长良好，10 μmol/L顺铂作用HeLa细胞24 h后抑制效应不明显(P>0.05)，20、40、80、160 μmol/L顺铂对HeLa细胞有明显的抑制效应(P<0.05)，且随着时间的延长和浓度的增加，其抑制作用越来越明显，呈时间浓度依赖性特点(图1)。由于20 μmol/L顺铂作用24 h后对细胞已有明显的抑制作用，因此后面的实验中选用20 μmol/L为药物作用浓度。

　　2.2 转染寡核苷酸最佳条件的选择和转染效率的检测

　　用FITC标记的寡核苷酸转染HeLa细胞，24 h后用荧光倒置显微镜观察转染效率，发现在0.3、0.4、0.5 μg/μL DNA/Lipofectamine 2000脂质体时的转染效率都可达到99%，其中0.4 μg/μL DNA/Lipofectamine 2000脂质体时转染效率最高(图2)。

　　2.3 chk2反义寡核苷酸对HeLa细胞Chk2蛋白表达的影响

　　应用Western blot技术，以GAPDH作为内对照，比较顺铂组、空脂质体组及转染chk2正义链和反义链组Chk2蛋白的表达情况(图3)。结果显示：空脂质体组及转染chk2正义寡核苷酸组Chk2蛋白的表达(Chk2/GAPDH灰度比分别为0.46和0.45)与顺铂组(Chk2/GAPDH灰度比为0.46)比较无明显差异(P>0.05),而转染chk2反义寡核苷酸组Chk2蛋白的表达(Chk2/GAPDH灰度比为0.30)明显降低(P<0.01)。

　　2.4 chk2反义寡核苷酸对顺铂作用下HeLa细胞凋亡的影响

　　2.4.1 Annexin V/PI流式细胞仪检测法结果

　　流式细胞仪检测计算得到转染chk2反义寡核苷酸后顺铂诱导的细胞凋亡率为(41.53±1.05)%，明显高于转染chk2正义寡核苷酸组(13.30±1.12)%(P<0.01)(图4，表1)。表1 流式细胞仪检测转染chk2反义链和正义链后，用顺铂处理24 h后各组HeLa细胞的凋亡率

　　2.4.2 TUNEL染色结果

　　镜下观察凋亡细胞的细胞核中出现明显的棕黄色颗粒，计数平均一个高倍视野中凋亡细胞所占的比例即细胞凋亡率。结果显示：转染chk2反义寡核苷酸链后HeLa细胞在顺铂作用下凋亡率为45.3%，是转染chk2正义寡核苷酸链组(15.1%)的3倍(P<0.05，图5)。检测结果与Annexin V/PI流式细胞仪检测法获得结果一致。

　　3 讨 论

　　顺铂(cisplatin, DDP)是目前发现的抗癌活性最强的药物之一，以DDP为主或有DDP参加配伍的化疗方案占所有方案的78%-80%。但肿瘤对顺铂的耐药性影响了顺铂的治疗效果，因而进行化疗增敏或寻找新的治疗手段具有重要意义[5]。chk2是近年来发现的细胞周期调控基因。细胞在DNA损伤发生后，chk2激活导致细胞周期阻滞并激活DNA损伤修复系统，以维持细胞基因组的稳定性[6]，使细胞能正常增殖分化，避免凋亡。研究报道，蛋白酶抑制剂UCN-01可抑制Chk2表达，消除药物和放射线作用后细胞周期阻滞，增加细胞毒作用[7-9]。Bull等[10]报道,分子伴侣Hsp90抑制剂17-DMAG通过抑制Chk2表达，使3株人肿瘤细胞的放射敏感性增加，在体内可以抑制照射后肿瘤的生长。国内有研究报道chk2反义寡核苷酸可明显提高白血病细胞对药物治疗的敏感性[11]。因此，我们推测抑制chk2的表达可能增加宫颈癌对顺铂的凋亡敏感性。

　　本实验结果显示顺铂对HeLa细胞生长有明显的抑制作用，且随着时间延长和浓度增加，其抑制作用越来越明显，呈时间浓度依赖性特点。另外，合成chk2反义寡核苷酸，通过脂质体转染Hela细胞，检测Chk2蛋白表达及顺铂作用下细胞凋亡情况。由于脂质体和寡核苷酸的毒性可诱导细胞的非特异性凋亡，我们同时合成chk2正义寡核苷酸，以转染chk2正义寡核苷酸组和空脂质体组作为对照，并通过检测DNA/Lipofectamine 2000不同比例混合时的转染效率，确定了最佳转染条件0.4 μg/μL，以准确反映chk2反义寡核苷酸对细胞的特异性促凋亡作用。采用Western blot法检测Chk2蛋白的表达，并经灰度扫描分析得到半定量结果显示：Chk2在转染反义寡核苷酸的细胞中表达明显降低，说明Chk2蛋白的表达受chk2的反义寡核苷酸有效抑制，而不受其正义链的影响。用流式细胞术和TUNEL法检测DDP作用的结果表明，转染chk2反义寡核苷酸可特异性促进DDP诱导的细胞凋亡。

　　综上所述，采用反义寡核苷酸可以有效地抑制Chk2蛋白的表达，并明显增加顺铂诱导的HeLa细胞凋亡，因此，chk2有希望成为宫颈癌增敏治疗的有效靶点。

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　　[11]黄伟，张瑶珍，周剑峰，等. Chk1/2反义寡核苷酸对顺铂作用下K562细胞凋亡的影响 [J].中国实验血液学杂志, 2004,12(5):563-567.