卵巢癌的基因治疗研究现状及展望

　　作者：陈乃军 综述,孙秀芳 审校 作者单位：山东省泰安市第一人民医院妇产科，山东 泰安 271000

　　【摘要】 随着分子生物学及相关学科的发展, 基因治疗可望成为治疗恶性肿瘤的重要方法。目前基因治疗应用于卵巢癌的临床前实验研究已取得较大进展, 给卵巢癌特别是晚期患者的治疗带来新的希望。卵巢癌基因治疗的方法主要有自杀基因治疗、基因表达封闭、多药耐药基因治疗、联合基因治疗等，现综述近几年来卵巢癌基因治疗的研究进展。

　　【关键词】 卵巢癌;基因治疗;综述

　　卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一, 由于其组织学类型较多, 缺乏有效的早期诊断方法, 且手术和放化疗疗效不佳, 卵巢癌患者的5年生存率仍较低, 成为严重威胁妇科肿瘤患者生命的恶性疾病。在对于卵巢癌治疗方法的探索中, 基因治疗令人瞩目, 在动物实验及一些Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期临床研究中取得了一定疗效, 成为继手术、化疗、放疗之后的一种全新的治疗模式。

　　1 卵巢癌相关基因

　　和其他肿瘤一样,卵巢癌的发生是与细胞增殖分化相关的癌基因、抑癌基因多阶段相互作用的结果。目前已发现K-ras、c-myc、c-erb-B2等癌基因和p53、p16等抑癌基因与卵巢癌密切相关，充分认识卵巢癌特异性基因损害的机制有利于制定合理的基因治疗方案。K-ras 编码蛋白p21 ,通过点突变被激活,使其丧失三磷酸鸟苷酸(GPT)激酶活性,致GTP降解成二磷酸鸟苷酸(GDP)的速度减慢,持续的激活靶分子,使细胞持续增殖,从而导致癌的形成[1]。c-myc编码一种转录因子,与细胞周期由G0期向G1期的转变有关，c-myc的扩增和过度表达,使其丧失了转录控制能力, 以致促使细胞大量增殖[2]。c-erb-B2编码一种细胞表面蛋白,结构与表皮生长因子受体(EGFR)相似,在乳腺癌和卵巢癌的发生中起重要作用[3]。还有一些癌基因如int2、fms、mdd、akt2、c-fos、H-ras、raf-1等,在卵巢癌中偶尔扩增,但并不被认为起重要作用。p53基因是目前研究最深入的抑癌基因,30%～80%的卵巢癌患者存在p53突变。p53其功能好比“分子警察”,监视着细胞基因组的完整性,如果DNA受损,则p53基因通过转录调控机制使细胞分裂停滞于G1期, 以便细胞有足够的时间修复损伤，若修复失败,则启动程序化死亡而引发细胞自尽,即细胞凋亡。此外,p53 蛋白的积累可能加速原发肿瘤的转移和扩散。p53缺陷对化疗的耐受有决定意义[4-5]。多肿瘤抑制基因(MTS1)是人们发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因,其编码蛋白为p16,通过与细胞周期素(cyclinD1)竞争性结合细胞周期素依赖激酶(CDK4),从而使CDK4失活,阻止细胞由G1期进入S期,进而抑制细胞分裂并阻止其向恶性方向发展[6]。

　　2 卵巢癌基因治疗机制

　　肿瘤的发生是多因素、多步骤过程,包括了癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活而导致细胞增殖增强与凋亡受到抑制。卵巢癌的发生亦是与细胞增殖分化相关的癌基因、抑癌基因多阶段相互作用的结果，如:erbB、c-myc、K-ras等癌基因的突变与扩增和(或)抑癌基因RB、p53、p16 等的功能丧失均可导致肿瘤发生。通过基因治疗即把正常基因或重组治疗基因经分子生物学技术手段转入异常细胞的DNA系统中,以抑制致病基因表达或修复缺陷基因表达,起到治疗作用[7]。目前,卵巢癌基因治疗方案主要有:自杀基因治疗、基因表达封闭、多药耐药基因治疗和联合基因治疗。

　　3 卵巢癌基因治疗载体

　　实现肿瘤基因治疗的关键是要使用高效、安全的基因导入系统。常用病毒和非病毒系统作为基因导入载体。病毒载体能有效地将原位基因导入肿瘤细胞中,这种带有抗癌基因并特异性杀伤肿瘤细胞的病毒被称之为基因-病毒系统。体内外实验表明,腺病毒介导的卵巢癌转基因治疗能有效抑制卵巢癌细胞生长,并延长卵巢癌小鼠模型生存期[8]。非病毒的质粒内插入具有治疗作用的目的基因及所有顺式调控元件如启动子、增强子及沉默子序列和转录处理信号时,就可用于哺乳细胞的转染,当含有一个病毒复制子时,即可指导质粒在靶细胞核中扩增。质粒与病毒载体相比,虽然基因转染率较低,但不会整合入宿主的基因组而产生致病的野生型病毒。近年来以质粒为载体的基因治疗多使用阳离子脂质体为导入介质,目前阳离子脂质体介导的转基因治疗卵巢癌已进入Ⅰ期临床试验[9]。基因载体系统增强抗癌能力的方法有:①在载体上携带多种治疗基因联合作用,以提高病毒对癌细胞的杀伤力;②修饰载体的外壳蛋白使其特定地与肿瘤细胞结合,并增加其对肿瘤细胞的亲和力;③调控载体的肿瘤特异性启动子或增强子,使治疗基因的表达限于肿瘤细胞,避免对非肿瘤细胞造成伤害。理想的靶向性基因转移载体一直是学者们努力的方向。

　　基因重组技术可利用肿瘤细胞表面一些特异性高表达的受体或抗原,编码与这些受体或抗原特异性结合的基因片段插入到病毒外壳糖蛋白(Env)基因中,使该载体表面出现一种嵌合Env,从而提高病毒对宿主细胞的亲和性,同时降低它与非靶细胞结合的机会[10]。结构蛋白VP22是Ⅰ型单纯疱疹病毒的主要壳膜蛋白,有细胞间扩散作用的特性,可改善基因治疗效率。VP22和胸苷激酶(tk)融合基因及丙氧鸟苷自杀基因系统对肿瘤细胞具有特异靶向性生长抑制作用,利用卵巢癌细胞表面高表达的Ⅰ型跨膜粘蛋白MUC1,将抗MUC1单链抗体ScFv与VP22 载体的包膜结构VSVG的转膜区和胞质区部分构建到一起，以此膜结构包装的目的基因VP222tk能靶向性的结合并杀伤表达MUC1的卵巢癌肿瘤细胞[11~13]。

　　近年来研究发现,柯萨奇腺病毒受体(CAR)在病毒细胞的入口中起决定作用，在腺病毒载体的临床实验中,CAR表达水平上调有利于腺病毒基因系统导入卵巢癌细胞系,并增强表达p53腺病毒的细胞毒作用，该作用是由于CAR是细胞黏附蛋白,并可分裂细胞与细胞间的连接,因而使腺病毒基因系统更易导入癌细胞[14-15]。此外，在卵巢癌细胞系和原发卵巢癌中表达的CD40是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一,在CD40腺病毒靶向系统中可增加靶基因融合蛋白的数量并有剂量依赖性,CD40 介导的载体病毒转染可被用于不依赖CAR途径的基因转换,这就解决了CAR表达水平低的肿瘤细胞基因转染问题[16]。

　　4 卵巢癌的基因治疗策略

　　4.1 自杀基因治疗 自杀基因治疗卵巢癌是近年来研究的热点，其中有组织特异性启动子OSP-1(ovarian-specific promoter-1)参与调控，使自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(erpes simplex virus thymidine kinase，HSV-tk)与前体药物无环鸟苷(ganciclovir，GCV)结合，HSV-tk/GCV通过转染肿瘤细胞使tk基因在癌变的组织或细胞中特异地表达，从而使无毒的前体药物GCV转化为有细胞毒性的磷酸化的GCV产物，抑制DNA酶活性，阻止DNA合成，进而杀灭肿瘤细胞。HSV-tk 抗肿瘤效应的另一原理是“旁观者效应(bystander effect)”，即转导细胞对非转导细胞的细胞毒作用。已证实腺病毒介导的HSV-tk基因治疗裸鼠间皮瘤、结直肠癌、卵巢癌实验中可使肿瘤消退[17-18]。体外研究结果显示：与间皮细胞结合的HSV-tk对GCV杀灭肿瘤细胞的作用非常敏感，能增强GCV 的“旁观者效应”，使肿瘤生长受到明显抑制[19]。

　　4.2 基因表达封闭——RNA干扰(RNAi) RNAi在哺乳类动物细胞中是利用同源双链小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)诱导特异性基因表达抑制，其主要发生于转录后基因水平，所以又称为转录后基因沉默(post transcription gene silencing，PTGS)。双链RNA(double strand RNA，dsRNA)首先被切割为siRNA，siRNA 与一些蛋白形成RNA 引导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)，介导基因表达沉默。由于RNAi的特异性、高效性、方便性，已成为研究基因功能、肿瘤基因治疗的新方法。Wani等[20]利用RNAi技术抑制肝细胞刺激因子-1在卵巢癌透明细胞瘤中的表达，使其mRNA水平分别降低45%，并诱导其细胞凋亡增加。Bignotti等[21]将脂肪酸合酶(fattyacid synthase，FAS)的siRNA转染到培养的卵巢癌SKOV3细胞中，导致FAS基因的表达沉默，与对照组相比，HER2的表达下降60%并诱导细胞凋亡。以上研究结果表明，利用RNAi技术对于治疗和预防卵巢癌具有一定的作用并显示出巨大的发展潜力。

　　4.3 多药耐药基因治疗 化疗是治疗卵巢癌的常用和有效的手段，但肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉抗药性(multidrug resistance，MDR),是造成化疗失败的主要原因。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)在卵巢癌细胞中过表达，与卵巢癌化疗的多药耐药的发生密切相关，而P-gp被MDR基因所编码。研究者利用反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ODNs)抑制MDR基因而降低P-gp的转录，其中双链ODNs比单链ODNs作用更有效，可阻遏卵巢癌细胞A2780中P-gp的表达，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[5，9]。Bcl-2基因在卵巢癌细胞中高表达并参与化学药物耐药的发生，E1A 基因联合反义寡核苷酸Bcl-2(antisense oligonucleotide Bcl-2，Bcl-2-ASO)治疗卵巢癌可明显促进癌细胞凋亡(凋亡能力的提高主要是由于细胞色素C的释放以及Bcl-2-ASO激活caspase-9所致)，抑制癌细胞增殖，减少耐药性的发生[15]。

　　4.4 联合基因治疗 卵巢癌的发生是多种致病因素相互作用的结果，针对一种因素的治疗往往不能使肿瘤的生长受到明显抑制，而各种自杀基因系统发挥作用的机制并不相同。比如CD和HSV-tk融合蛋白的表达可使抑制肿瘤的效应明显增高。自杀基因发挥旁观者效应主要取决于机体自身的免疫力即免疫反应的强弱，自杀基因系统可分别与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素2(IL-2)、干扰素(IFN)等免疫细胞因子有效结合，一方面对肿瘤细胞有直接杀伤作用，另一方面又可使机体对肿瘤的免疫应答提高，发挥其旁观者效应从而使肿瘤生长受到抑制。针对卵巢癌的RNAi技术可同时抑制肿瘤发病的几个关键基因，从而抑制肿瘤生长[22]。

　　5 卵巢癌基因治疗的临床应用

　　由于实验室的研究结果令人鼓舞,卵巢癌基因治疗的临床试验正在进行中,目前已完成了利用不同的转染途径将目的基因应用于人卵巢癌的分子治疗。Haralambieva等[23]在其Ⅰ期临床试验中,利用逆转录病毒载体转染BRCA1基因对复发性晚期卵巢癌患者进行临床治疗,观察到载体稳定表达,抗体反应很小,肿瘤消退。但在其Ⅱ期临床试验中,在对未广泛转移的早期卵巢癌患者,应用同样的方法,由于载体表达不稳定和很快产生抗体反应,不得不终止治疗。他们认为免疫系统状态在基因治疗的有效性上起到关键作用。Menczer等[24]利用未改进的腺病毒载体介导转染HSV-tk基因于复发性卵巢癌患者,29%的病例有一过性可控制的与载体有关的发热。Psyrri等[25]利用腺病毒载体将野生型p53基因转入复发性卵巢癌患者的腹腔,患者有可接受的毒性,与顺铂结合治疗,可使血CA125下降和症状改善。

　　6 卵巢癌基因治疗的展望

　　基因治疗为卵巢癌的治疗展现了一个极有希望的前景，无论是在动物试验或前临床试验中,卵巢癌基因治疗的方法、思路正在不断创新与完善。但基因治疗本身还存在着许多问题,如：载体转导的效率低、稳定性不佳及不能有效定位于靶组织或靶器官等。另外,多数肿瘤的形成都不是单一的基因突变,那么以单一突变基因为靶向的治疗很难控制整个肿瘤,所以需要加强多基因为靶向的实验研究。学者们正针对卵巢癌基因治疗中存在的一些问题如载体的改良、目的基因的靶向性等进行更加深入的研究, 相信随着分子生物学理论和技术的发展, 人类将开辟卵巢癌基因治疗的新纪元，卵巢癌的基因治疗必将能够成为一种常规的、有效的治疗手段。

　　【参考文献】

　　[1] Chen T, Wang Z, Wang R, et al. Polyethylenimine-DNA solid particles for gene delivery [J]. J Drug Target,2007,15(10):714-720.

　　[2] Ghataorhe P, Kurian AW, Pickart A, et al. A carrier of both MEN1 and BRCA2 mutations: case report and review of the literature [J]. Cancer Genet Cytogenet,2007,179(2):89-92.

　　[3] Schmutzler RK. Molecular genetics and clinics of hereditary breast cancer [J]. Verh Dtsch Ges Pathol,2005,89:25-34.

　　[4] Marchini S, Marabese M, Marrazzo E, et al. DeltaNp63 expression is associated with poor survival in ovarian cancer [J]. Ann Oncol,2007,12(5):367-369.

　　[5] Gatcliffe TA, Monk BJ, Planutis K, et al. Wnt signaling in ovarian tumorigenesis [J]. Int J Gynecol Cancer,2007,6(3):265-269.

　　[6] Wu HJ, Wu HT, Weng DH, et al. Reversal of drug resistance in human ovarian cancer cells by wild-type PTEN gene and its mechanisms [J]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2007,42(9):612-616.

　　[7] Takai N, Narahara H. Human endometrial and ovarian cancer cells: histone deacetylase inhibitors exhibit antiproliferative activity, potently induce cell cycle arrest, and stimulate apoptosis [J]. Curr Med Chem，2007，14(24):2548-2553.

　　[8] Puiffe ML, Le Page C, Filali-Mouhim A, et al. Characterization of ovarian cancer ascites on cell invasion, proliferation, spheroid formation, and gene expression in an in vitro model of epithelial ovarian cancer [J]. Neoplasia，2007，9(10):820-829.

　　[9] Lou JY, Peng ZL, Zheng Y, et al. Research on human ovarian cancer cell MDR1 gene silenced by siRNA [J]. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2007,38(5):753-755.

　　[10] Saldivar JS, Wu X, Follen M, et al. Nucleotide excision repair pathway review I: implications in ovarian cancer and platinum sensitivity [J]. Gynecol Oncol,2007,107(Suppl 1):S56-71.

　　[11] Ludwig AH, Bujko M, Bidzinski M, et al. CHFR gene is neither mutated nor hypermethylated in ovarian cancer [J]. Cancer Detect Prev,2007,31(3):257-261.

　　[12] Milczek T, Klasa-Mazurkiewicz D, Emerich J, et al. DNA ploidy and results of first line chemotherapy in ovarian cancer patients [J]. Ginekol Pol,2006 ,77(8):589-596.

　　[13] Morari EC, Lima AB, Bufalo NE, et al. Role of glutathione-S-transferase and codon 72 of P53 genotypes in epithelial ovarian cancer patients [J]. J Cancer Res Clin Oncol,2006,132(8):521-528.

　　[14] Park JT, Li M, Nakayama K, et al. Notch3 gene amplification in ovarian cancer [J]. Cancer Res,2006,66(12):6312-6318.

　　[15] Indraccolo S, Tisato V, Agata S, et al. Establishment and characterization of xenografts and cancer cell cultures derived from BRCA1-/-epithelial ovarian cancers [J]. Eur J Cancer,2006, 42(10):1475-1483.

　　[16] Zhang L, Huang J, Yang N, et al. microRNAs exhibit high frequency genomic alterations in human cancer [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(24):9136-9141.

　　[17] Pongstaporn W, Rochanawutanon M, Wilailak S, et al. Genetic alterations in chromosome 10q24.3 and glutathione S-transferase omega 2 gene polymorphism in ovarian cancer [J]. J Exp Clin Cancer Res,2006,25(1):107-114.

　　[18] Novichkov EV, Votintsev AA. Ovarian cancer prognosis and expression of receptors to sex hormones and proliferative activity of tumor cells [J]. Arkh Patol,2006,68(2):10-13.

　　[19] Agarwal R, Kaye SB. Expression profiling and individualisation of treatment for ovarian cancer [J]. Curr Opin Pharmacol,2006,6(4):345-349.

　　[20] Wani AA, Sharma N, Shouche YS, et al. Nuclear-mitochondrial genomic profiling reveals a pattern of evolution in epithelial ovarian tumor stem cells [J]. Oncogene,2006,25(47):6336-6344.

　　[21] Bignotti E, Tassi RA, Calza S, et al. Differential gene expression profiles between tumor biopsies and short-term primary cultures of ovarian serous carcinomas: identification of novel molecular biomarkers for early diagnosis and therapy [J]. Gynecol Oncol,2006,103(2):405-416.

　　[22] Menendez L, Walker D, Matyunina LV, et al. Identification of candidate methylation-responsive genes in ovarian cancer [J]. Mol Cancer,2007,(6):10-15.

　　[23] Haralambieva I, Iankov I, Hasegawa K, et al. Engineering oncolytic measles virus to circumvent the intracellular innate immune response [J]. Mol Ther,2007,15(3):588-597.

　　[24] Menczer J, Schreiber L, Czernobilsky B, et al. Is Her-2/neu expressed in nonepithelial ovarian malignancies?[J]. Am J Obstet Gynecol,2007, 196(1):79.e1-4.

　　[25] Psyrri A, Kountourakis P, Yu Z, et al. Analysis of p53 protein expression levels on ovarian cancer tissue microarray using automated quantitative analysis elucidates prognostic patient subsets [J]. Ann Oncol,2007,18(4):709-715.