PPARγ和MMP9在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织的表达及其临床意义

　　作者：张阳, 苟文丽    作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院妇产科, 陕西西安 710061)　　【摘要】 目的 探讨PPARγ和MMP9在妊娠期高血压疾病(HDCP)发生发展中的表达及其临床意义。方法 利用免疫组化SP法检测正常妊娠者31例(对照组)和HDCP患者36例(实验组)胎盘组织中PPARγ、MMP9表达,探讨其与HDCP的关系。结果 ①PPARγ在实验组胎盘组织中明显高表达, 与对照组比较有显著差异(P<0.05), PPARγ阳性表达率随病情加重而显著增高。②MMP9在实验组胎盘组织中呈低表达, 与对照组比较有显著差异(P<0.05)，MMP9阳性表达率随病情加重而显著降低。③PPARγ与MMP9的Pearman相关分析显示二者表达水平呈负相关(r=-0.529，P<0.01)。结论 PPARγ在HDCP患者胎盘中呈高表达，MMP9在HDCP患者胎盘中呈低表达, 提示其可能通过抑制滋养细胞的浸润能力而参与HDCP的发病。

　　【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体γ;基质金属蛋白酶9;妊娠期高血压疾病;胎盘;免疫组化

　　Expressions and clinical significance of PPARγ and MMP9 in placental

　　tissues of patients with hypertensive disordercomplicating pregnancyZHANG Yang, GOU Wenli

　　(Department of Gynecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To investigate the expressions and clinical significance of PPARγ and MMP9 in the genesis and development of hypertensive disordercomplicating pregnancy (HDCP). Methods The expressions of PPARγ and MMP9 in placenta of 31 normal pregnant women (control group) and 36 pregnant women with hypertensive disordercomplicating pregnancy (experimental group) were detected by using SP method of immunohistochemistry, and the relationship between PPARγ and MMP9 expressions and hypertensive disordercomplicating pregnancy was explored. Results ① PPARγ expression in placental tissues was significantly higher in the experimental group than in the control group (P<0.05); PPARγ with positive expression rate of exacerbations was significantly increased. ② MMP9 expression in placental tissues showed low expression in the experimental group, which was significantly different from that in the control group (P<0.05); MMP9 with positive expression rate of exacerbations was significantly decreased. ③ The Pearman correlation analysis of PPARγ and MMP9 showed that the expression level of the two had a negative correlation (r=-0.529, P<0.01). Conclusion PPARγ has a high expression in the placenta of patients with HDCP while MMP9 has a low expression, suggesting that they may be involved in the pathogenesis of HDCP by inhibiting the infiltration capacity of nourishing cells.

　　KEY WORDS: peroxisome proliferationactivated receptor γ(PPARγ); matrix metalloproteinase 9; (MMP9); hypertensive disordercomplicating pregnancy (HDCP); placenta; immunohistochemistry

　　妊娠期高血压疾病(HDCP)是妊娠期特有的疾病,我国发病率为9.4%～10.4%, 严重影响母婴健康, 是孕产妇和围生儿患病率及死亡率的主要原因, 发病机制不明。最近研究发现滋养细胞浸润能力下降是HDCP的主要原因之一[1]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferationactivated receptorγ, PPARγ)是一类配体启动的核转录因子, 在转录水平上调控多种细胞的增殖、侵袭、分化和凋亡。PPARγ在胎盘形成中起重要作用, 不仅对滋养细胞浸润分化是必需的, 而且可建立成熟的母胎转运。研究发现PPARγ的表达或活性增加可以抑制体外培养人类滋养细胞的浸润，因此其可能影响滋养细胞的正常浸润，在HDCP的发病过程中起一定作用。MMP9分解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原，是参与细胞滋养细胞浸润的关键酶，许多胎盘激素和细胞因子对滋养细胞浸润的调节都是通过控制MMP9的分泌而实现的，所以MMP9在滋养细胞浸润过程中起重要作用。本研究通过免疫组化SP染色法，检测HDCP患者与正常孕妇胎盘组织中PPARγ和MMP9的表达, 揭示其在HDCP发生发展中的表达,探讨两者的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料 选取西安交通大学医学院第一附属医院2008年4月～10月住院初产妇HDCP患者36例(妊娠期高血压10例,轻度子痫前期13例,重度子痫前期13例)作为实验组,同时随机选取同期剖宫产结束妊娠的正常初产妇31例为对照组。所有对象均无肝炎、结核等急慢性传染病史,无心脏病及肝肾疾病史,无其他妊娠合并症及并发症。诊断标准依据乐杰教授主编的第七版《妇产科学》。两组孕妇年龄、孕龄比较均无统计学差异(P>0.05), 实验组胎盘重量和新生儿体重明显低于对照组(P<0.05)。

　　1.2 检测方法

　　1.2.1 取材 所有标本均于胎盘娩出后10min内收集，迅速称量胎盘重量，于胎盘母体面近脐带处避开钙化点区取胎盘组织约1.5cm×1.0cm×0.5cm大小, 置于40g/L中性多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片，HE染色后观察典型组织为入选标本。

　　1.2.2 PPARγ、MMP9测定 兔抗人PPARγ多克隆抗体、兔抗人MMP9多克隆抗体、SP型免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司，具体操作参照说明书。采用免疫组化SP法测定胎盘组织PPARγ、MMP9的表达。每批染色均设阳性对照(公司提供)和阴性对照[磷酸盐缓冲溶液(PBS)]代替一抗。

　　1.3 结果分析 采用德国LEICA公司生产的生物医学图像分析系统(Q550CW)进行灰度定量分析, 由显微摄像机将切片图像输入计算机,每张切片随机选取5个不重叠高倍视野, 分别计算每个视野PPARγ及MMP9的平均灰度值,求出每例胎盘标本的平均灰度值。用平均灰度值代表PPARγ及MMP9在胎盘的表达水平。阳性区表达的强弱和灰度值呈负相关,灰度值越大则阳性表达越弱,灰度值越小则阳性表达越强。

　　1.4 统计学方法 所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行处理，结果用(±s)表示，临床资料和平均灰度值比较采用t检验，P<0.05为有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 PPARγ在胎盘组织的表达情况 PPARγ主要表达于胎盘绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及蜕膜细胞的细胞核上, 在胎盘绒毛和蜕膜的间质中也有表达。PPARγ在对照组、实验组灰度值表达有显著性差异(P<0.05)。妊娠期高血压与对照组之间比较无显著性差异(P>0.05), 轻度子痫前期、重度子痫前期与对照组比较存在显著性差异(P<0.05)。见图1、图2。

　　2.2 MMP9在胎盘组织的表达情况 MMP9主要表达于胎盘绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及蜕膜细胞的细胞质中，胎盘绒毛血管内皮细胞及间质少量表达。MMP9在对照组、实验组灰度值比较有显著性差异(P<0.05)。对照组与妊娠期高血压之间比较有显著性差异(P<0.05), 轻度子痫前期、重度子痫前期与对照组比较存在显著性差异(P<0.05)。见表1、图3、图4。表1 PPARγ及MMP9在胎盘组织的平均灰度值

　　2.3 PPARγ和MMP9的相关性分析 实验组PPARγ和MMP9在胎盘组织中的表达水平进行Pearson相关分析, PPARγ和MMP9的表达水平呈负相关(r=-0.529，P<0.01)。见图5。

　　3 讨 论

　　过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferationactivated receptorγ, PPARγ)属Ⅱ型核受体超家族成员, 是参与多种生物学效应的核受体, 除与脂质代谢、炎症、心血管疾病、糖尿病、肥胖等一系列生理过程密切相关外，还对细胞的生长、分化甚至凋亡有重要影响。PPARγ的配体分为天然配体和合成配体。天然配体主要来源于食物和机体的代谢产物,如亚油酸、亚麻酸、前列腺素及其代谢产物等。PPARγ合成激动配体包括：噻唑烷二酮类(TZDs);羧酸类激动剂和其他类型激动剂, 如非甾体类抗炎药(NSAIDs)等[2]。FOURNIEDR[3]等发现利用PPARγ的激动剂合成配体(罗格列酮)和天然配体(15PGJ2)可以抑制体外培养的人类滋养细胞浸润, PPARγ的激动受体可以影响滋养细胞的正常浸润，引起HDCP的发生。FOURNIER等[4]研究发现鼠类在胚胎形成的第8天就可在胎盘中表达PPARγ，其分布在母胎界面的滋养细胞上，而PPARγ基因敲除的小鼠胎盘形成障碍，胚胎死亡率增加，滋养细胞浸润受阻及血管重铸障碍， 说明PPARγ在胎盘的发育中起了至关重要的作用。研究发现PPARγ能抑制滋养细胞的浸润性， 对滋养细胞的侵袭行为起负调控作用。PPARγ受体在胎盘上有许多重要的功能，包括滋养细胞分化、入侵和摄取胎儿宫内发展重要的脂肪酸和在滋养层中作为合成类固醇激素的前体。此外，利用激动剂激活PPARγ受体可能通过抑制胎膜炎症反应来降低的早产风险[5]。本实验应用免疫组化SP法检测HDCP患者和正常孕妇的胎盘组织中PPARγ的表达，结果显示HDCP患者胎盘组织中PPARγ表达水平明显高于正常孕妇，且随病情加重升高，而在二者胎盘组织中PPARγ的分布基本一致，主要位于绒毛滋养细胞，提示PPARγ的过度表达限制了滋养细胞的正常浸润能力，导致滋养细胞侵入过浅，使胎盘螺旋小动脉重新生成障碍，胎盘浅着床，最终引发HDCP。

　　基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9, MMP9)是REPONE和SAHLBERG1994年在小鼠胚胎发育中的破骨细胞内发现的, 分子量为Mr 92×103。MMP9作用底物主要是层粘连蛋白、Ⅳ、Ⅴ型胶原和Ⅰ、Ⅴ型明胶和弹性蛋白, 使用金属蛋白酶抑制剂和MMP9的特异性抗体能完全抑制细胞滋养细胞的侵蚀性，且Ⅳ型胶原为内皮细胞基底膜所特有，因此MMP9在滋养细胞侵蚀及血管重铸中发挥重要作用。LI[6]等通过免疫组化方法测量20名正常孕妇和20名妊娠期高血压疾病患者的胎盘中MMP2、MMP9的表达，同时利用实时PCR技术测量两组人群的基因MMP2、MMP9，结果发现在妊娠期高血压疾病患者胎盘中MMP2和MMP9表达显著下降，妊娠期高血压疾病胎盘中MMP2、MMP9的低表达可能导致侵滋养层细胞浸润受阻致胎盘浅着床，从而引起妊娠期高血压疾病的发生。本研究发现，HDCP患者绒毛上皮细胞的MMP9 阳性表达明显低于正常妊娠组, 而且与病情的严重程度呈正相关，MMP9的表达呈下降趋势明显有统计学意义，进一步证明了MMP9分泌不足使滋养细胞对子宫内膜侵蚀表浅和螺旋小动脉侵蚀受阻, 会造成胎盘浅着床和胎盘缺血、缺氧的HDCP特征性病理生理改变,以致最终发展为HDCP。

　　妊娠期高血压疾病是一类具有高血压、水肿、蛋白尿的妊娠综合征, HDCP发病常分为两个阶段：第一阶段是滋养层细胞浅着床，引起胎盘循环缺氧，同时释放的可溶性因子和滋养细胞碎片释放入母体血循环。第二阶段上述因子引起相应产科并发症。但该病的发病机制至今不清，研究发现滋养细胞浸润能力下降是导致HDCP的主要原因之一[1]。研究发现PPARγ、MMP9在妊娠整个过程中的各环节都有着一定作用，均可使妊娠滋养细胞的浸润增强及分解细胞外基质成分，为受精卵着床及胎盘的植入、胎盘绒毛血管的新生起到了重要的作用，而PPARγ、MMP9表达的异常可能导致病理妊娠如HDCP的发生。研究发现在一些类型细胞中转录因子PPARγ可通过调节下游MMP9发挥作用。LEE[7]等研究在脑缺血组织中，PPARγ被配体吡格列酮激活后可下调MMP9的表达，改变了细胞外基质的成分，利用吡格列酮能减少脑梗死面积，说明PPARγ激活后降低了MMP9活性, 减少了MMP9对细胞外基质的降解作用。本实验结果显示，在胎盘绒毛组织中PPARγ表达与MMP9呈负相关(r=-0.529，P<0.01)，提示在滋养细胞中PPARγ可能是通过调节MMP9的表达而影响滋养细胞的浸润。说明二者在HDCP胎盘中可能协同发挥作用，参与了HDCP的发生、发展。

　　PPARγ、MMP9在HDCP中的发病机制尚未完全明了, 但已确定的是两个因子在HDCP发病中起到了非常重要的作用。PPARγ和MMP9可能通过协同作用影响滋养细胞的浸润过程, 使滋养细胞的侵袭能力降低，从而导致胎盘植入过浅，引发一系列病理生理变化，最终导致HDCP的发生。因此，临床上可以采取措施维持PPARγ、MMP9的正常表达水平来预防及治疗HDCP。

　　【参考文献】

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　　[3]FOURNIER T, HANDSCHUH K, TSATSARIS V, et al. Role of nuclear receptors and their ligands in human trophoblast invasion [J]. J Reprod Immunol, 2008, 77(1):16170.

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　　[6]LI JK, XIONG Q, ZHOU S, et al. Differences between the expression of matrix metalloproteinase2, 9 in preeclampsia and normal placental tissues [J]. Zhonghua Fuchanke Zazhi, 2007, 42(2):7375.

　　[7]LEE SR, KIM HY, HONG JS, et al. PPAR gamma agonist pioglitazone reduces matrix metalloproteinase9 activity and neuronal damage after focal cerebral ischemia [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 380(1):1721.