甲氨蝶呤对假孕大鼠输卵管组织学及超微结构的影响

　　作者：陈燕萍，郑飞云，杨孝军，王汉楚 作者单位：(温州医学院附属第一医院 妇产科，浙江 温州 325000)

　　【摘要】 目的：观察不同剂量甲氨蝶呤(MTX)对假孕SD大鼠输卵管组织学及超微结构的急性期及远期损伤。方法：72只SD雌性大鼠，致假孕状态后再行MTX腹腔注射：1 mg/kg组(Ⅰ)、2 mg/kg组(Ⅱ)、5 mg/kg组(III)及腹腔注射生理盐水对照组，每组18只。10 d、2个月后分别杀取各组半数大鼠的输卵管壶腹部组织，行常规组织学和透射电镜检测。结果：①光镜下MTX处理后10 d的各组输卵管标本中，均出现输卵管间质水肿及炎性细胞浸润，并随MTX剂量增大而加重，且组Ⅲ中炎性细胞浸润至输卵管上皮全层，对照组则无明显改变。急性期输卵管炎症在2个月后逆转为正常。②透射电镜下MTX处理后10 d的各组输卵管标本中，均出现上皮细胞纤毛消失或减少，并随MTX剂量增大而加重，但组Ⅰ的纤毛消失在2个月后表现为可逆，组Ⅱ、Ⅲ的损伤在2个月后表现为不可逆。且组Ⅲ在10 d及2个月的标本中，均出现纤毛细胞内线粒体水肿、空泡形成及结晶样物质形成;粗面内质网扩张并有电子致密物沉积;细胞核固缩;无纤毛细胞顶部的分泌颗粒代偿性增加。而对照组则无明显改变。结论 ：MTX作用后的输卵管出现了近期及远期、可逆或不可逆性的结构及功能的损伤，且损伤效应存在一定的量-效关系。

　　【关键词】 甲氨蝶呤;输卵管;组织学;超微结构

　　Effects of methotrexate on histology and ultrastructure of salpinx in pseudocyesis rat CHEN Yan-ping，ZHENG Fei-yun，YANG Xiao-jun，WANG Han-chu. Department of Obstetrics and Gynecology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou， 325000

　　Abstract: Objective: To investigate the acute and long-term injury of different doses of methotrexate (MTX) on histologiy and ultrastructure of osalpinx in pseudocyesis rats. Methods: Seventy-two SD pseudocyesis rats were randomly divided into 4 groups (n=18). Increasing doses of MTX were administrated to the rats by intraperitoneal injection: 1 mg/kg in group I， 2 mg/kg in group II and 5 mg/kg in group III. Rats were only received injections of physiological saline as control groups. Ten days and 2-month after drug injection， half of rats in each group were killed respectely and the fallopian tubes were removed and submitted to examination under light and transmission electron microscope (TEM). Results: ①Numerous infiltration of inflammatory cells within submucous membrane could be seen in the samples of ten days after MTX treatment under light microscopy. And it was serious with increasing doses of MTX. In group III，inflammatory cell infiltrated could be observed to epithelial lamina coule be seen. And In the control group the condition of all surface structures seemed normal.Yet， all surface structures returned to normal condition after 2-Month. ②In all samples of ten days after MTX treatment， ultrastructural examination showed loss of cilia in epithelial cells which was serious with increasing doses of MTX. Cilial decrease or loss from epithelial cells returned to normal condition after 2-Month in group I，while it was irreversible in group II and III. In group III， extensived crystalloid formation could be also observe and vacuolization occurred within the mitochondria; rough endoplasmic reticulum dilation and electron-dense mass deposited ; karyopyknosis occurred ;secretory granules on the top of the cilial was compensatorily increased. such ultrastructural changes can’t return to normal after 2-Month. But no obvious change could be found in the control group. Conclusion:Histological and ultrastructural alternations do occur within fallopian tubes resulting from MTX. Such complications can attribute to certain degree doses of MTX.

　　Key words: methotrexate;osalpinx;histology;ultrastructure

　　甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是输卵管妊娠的药物保守治疗中常用和首选的药物，该药可抑制滋养细胞增生，破坏绒毛，促使胚胎组织坏死、脱落，从而达到保守治疗输卵管妊娠的目的[1]。对于MTX保守治疗输卵管妊娠的确切疗效，对输卵管的损伤以及对后续妊娠的影响情况，目前多限于临床观察，各家报道结果不一[2-3]。我们首次系统研究不同剂量MTX对雌性假孕SD大鼠输卵管黏膜组织学及超微结构的急性损伤和远期恢复效应，以及可能的量-效关系，并进一步探讨MTX治疗后的输卵管损伤对后续妊娠的潜在影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物及试剂 雌性未孕SD(Sprague Dawley)大鼠72只，由温州医学院实验动物中心提供。甲氨蝶呤针剂购自江苏恒瑞医药股份有限公司(批号07020512);妊马血清促性腺激素针剂(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG) 购自杭州动物药品厂(批号060417)。人绒毛膜促性腺激素针剂(human chorionic gonadotropin，HCG) 购自丽珠集团制药厂(批号070307)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 假孕大鼠模型的制备及MTX处理：72只雌性SD大鼠，清洁实验动物条件下饲养，置于室温25 ℃，正常的昼夜光照，实验前参照文献[4]中使用的方法制作假孕模型，所有大鼠皮下注射PMSG 50 U，48 h后再次皮下注射hCG 100 U。致假孕状态后再行MTX腹腔注射，依剂量不同，假孕大鼠被随机分为4组(每组18只大鼠)：1 mg/kg(组I)、2 mg/kg(组II)、5 mg/kg(组III)，另设置腹腔注射生理盐水0.5 mL为对照组(组IV)，各剂量组及对照组分别在处理后10 d、2个月的时间点处死半数大鼠(10 d时处死9只，2个月时处死9只)，因输卵管妊娠多发生在壶腹部，因此本研究取邻近卵巢部位的双侧输卵管壶腹部组织。

　　1.2.2 组织学及超微结构观察：所有标本行10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色及光镜观察。另外每剂量组随机选取1例输卵管组织约1 mm3，依次经戊二醛、锇酸固定、丙酮脱水、环氧树脂包埋、半薄切片定位，光学显微镜观察定位，超薄切片、醋酸铀和柠檬铅双重染色，行透射电镜(H-600 HITACHI)检测。观察不同处理组中MTX对输卵管结构与功能的损伤效应，以及可能的量-效关系。

　　2 结果

　　所有假孕SD大鼠在处理后的10 d及2个月内均未观察到明显的异常行为，在实验取材过程中，各组大鼠的输卵管大体解剖均未发现明显的肉眼改变。

　　2.1 光镜下的形态学改变 MTX处理后10 d的输卵管标本中，组I光镜下可见输卵管内膜的柱状上皮细胞无明显改变，间质轻度水肿，少量炎性细胞浸润(见图1A)。组II和组III中的输卵管内膜柱状上皮与间质均出现炎性细胞浸润，浸润程度较组I更明显(见图1B)，组III中还可见到少量的嗜酸性粒细胞，炎性细胞浸润至上皮全层内(见图1C)。炎性反应随MTX作用剂量增大而加重。但这些急性期的炎性改变在2个月后对应MTX剂量组的输卵管标本中出现远期可逆现象，可恢复至近似正常结构。而对照组输卵管的光镜下结构无明显改变(见图1D)。

　　2.2 电镜下超微结构的改变 大鼠输卵管黏膜上皮主要由纤毛细胞和无纤毛细胞组成。对照组输卵管黏膜可见正常密集的纤毛细胞和无纤毛细胞。MTX处理后10 d的输卵管标本，在组I、II、III中均出现纤毛细胞的纤毛减少或缺失(见图2A)，组I改变较轻，但随MTX剂量增大，组II、III纤毛减少的程度亦加重;且组I的纤毛减少在2个月后出现了远期可逆现象，但组II、III的的纤毛减少或缺失在2个月后的观察时间内表现为不可逆。此外，组III在10 d及2个月的标本中，还出现纤毛细胞内的线粒体水肿、空泡形成(见图2B)及细胞核固缩，线粒体中央的结晶样物质形成(见图2C)，部分细胞核的核膜孔间隙扩大，无纤毛细胞顶部的分泌颗粒代偿性增加(见图2D)，组III的这些改变在观察时间内均表现为不可逆。

　　3 讨论

　　大鼠输卵管黏膜上皮主要由纤毛细胞和无纤毛细胞组成，纤毛细胞比较集中分布于皱襞顶部，纤毛高度与摆动朝向一致，无纤毛细胞零星散在于纤毛细胞间[5]，这些结构与其拾卵或输送受精卵的功能相适应。目前关于MTX对输卵管损伤的研究多集中在形态学结构的改变上，且结论不一，如黄健等[6]认为示输卵管注射MTX早期可引起输卵管内膜间质的水肿和炎性细胞的浸润，但其影响轻微、相对短暂，对输卵管本身的结构未造成不可逆的损害;最近Bayram等[7]的研究证实一定浓度的甲氨蝶呤，可对正常大鼠输卵管黏膜上皮造成定一定程度的急性损伤，改变黏膜层的组织学超微结构，且提示MTX可能会影响纤毛细胞的功能。但该研究未阐明输卵管黏膜急性损伤后的远期恢复情况，以及是否存在一定的量-效关系。本研究则从大鼠输卵管组织学及超微结构两个层面，综合研究MTX对输卵管黏膜的急性损伤和远期恢复效应。研究表明输卵管黏膜的光镜下急性炎性反应随MTX剂量增大而加重，且各剂量组处理后的输卵管急性期的炎性改变在2个月后出现远期可逆现象，输卵管可恢复至近似正常的形态学结构。透射电镜下还观察到低剂量组(1 mg/kg)的黏膜上皮纤毛细胞损伤在2个月后出现了远期可逆现象，但大剂量的组II、III中的纤毛细胞减少及缺失在2月后的观察时间内却表现为不可逆，不仅影响输卵管上皮层的纤毛细胞，导致纤毛细胞数量或质量的减少，并且大剂量组还出现了诸多细胞器超微结构的损伤，诸如：部分细胞核固缩，核膜间隙扩大，线粒体水肿及结晶样物质沉淀，无纤毛细胞呈现严重的代偿性分泌增加，均为不可逆性改变。可见，光镜下输卵管的炎性改变远期可逆，但电镜下输卵管组织中诸多超微结构的损伤在观察期限内，仍难以完全恢复至正常。

　　本研究提示，小剂量MTX治疗可能会对输卵管结构造成一定的急性损伤，但远期可逆，而逐渐增大MTX剂量时，会对输卵管黏膜结构，特别是输卵管上皮层的纤毛细胞产生不可逆的远期损伤。通常，输卵管黏膜的诸多结构如纤毛细胞等对拾卵或输送受精卵的功能起重要作用，纤毛高度与摆动朝向一致，有效的摆动能将受精卵向子宫方向运输，如果纤毛减少或缺失，或为纤毛活动提供所需ATP的线粒体中出现不同程度的空泡和结晶形成，均会使纤毛摆动显著减弱，且输卵管炎症及无纤毛细胞代偿性分泌增加均可影响其通畅，延缓受精卵在输卵管内的移行过程，形成新的致病因素，对后续妊娠造成一定的影响，导致治疗后不孕或再次宫外孕的发生。

　　【参考文献】

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　　[2]Gervaise A,Masson L,DE Tayrac R, et al. ReproductiveOutcome after Methotrexate Treatment of Tubal Pregnan-cies[J]. Fertil Steril, 2004, 82 (2): 304-308.

　　[3]Weiden R M,Karsdorp VH. Recurrent Cornual Pregnancyafter Heterotopic Cornual Pregnancy Successfully Treatedwith Systemic Methotrexate [J]. Arch Gynecol Obstet, 2005,273 (3): 180-181.

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　　[5]柯荣,潘玉琼. 生殖周期中大鼠输卵管漏斗部粘膜上皮超微结构的变化.[J].解剖科学进展，2003,9(3):219-223.

　　[6]黄健,杨正强,施公胜,等.兔输卵管注射甲氨蝶呤的实验研究[J].中国实用医学研究杂志,2003,2(6):610-612.

　　[7]Bayram M, Ozogul C, Dursun A, et al. Light and ElectronMicroscope Examination of the Effects of Methotrexateon the Endosalpinx [J]. European Journal of Obstetrics Gy-necology and Reproductive Biology,2005,120(1): 96-103.