槲皮素对人卵巢癌HO-8910细胞增殖与凋亡的影响

　　作者：汤艳 作者单位：锦州市中心医院妇产科，辽宁 锦州 121001

　　【摘要】 目的 探讨槲皮素对人卵巢癌HO-8910细胞增殖与凋亡的作用。方法 MTT 法测定细胞增殖情况;流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡;流式细胞仪检测槲皮素对凋亡相关蛋白Bcl-2、p53表达的影响。结果 槲皮素对HO-8910细胞有增殖抑制作用,呈时间、剂量依赖性;流式细胞术检测结果分析，实验组G1/G0期上升，S期和G2/M期下降，细胞凋亡率上升;流式细胞术结果显示，槲皮素使Bcl-2表达下调，而上调p53蛋白的表达。结论 槲皮素在体外能抑制卵巢癌HO-8910细胞的生长，阻止细胞由G1/G0期向S期和G2/M期移行并诱导细胞凋亡，其诱导HO-8910细胞凋亡的机制可能与上调促调亡蛋白p53表达和下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达有关。

　　【关键词】 槲皮素 卵巢癌 增殖 凋亡

　　The Effect of Quercetin on Proliferation and Apoptosis of HO-8910 Ovarian Cancer Cell

　　TANG Yan

　　Department of Obstetrics and Gynaecology，Jinzhou Central Hospital, Jinzhou 121001 China

　　Abstract： Objective To study the effect of quercetin on proliferation and apoptosis of HO-8910 ovarian cancer cell in vitro.Methods The proliferation of cells was detected by MTT method. Cell cycle and apoptotic percentage were analyzed by flow Cytometry (FCM). The expression of p53 and Bcl-2 were analyzed by FCM. Results Quercetin could inhibit the proliferation of HO-8910 cell as direct relation of concentrations and times. The flow cytometry showed that the proportion of G1 phase and the apoptotic rate were increased significantly in quercetin groups, the proportion of S phase and G2/M phase was reduced. In the FCM quercetin induced upregulation expression of p53 and downregulation expression of Bcl-2. Conclusions Quercetin could inhibit growth and induce apoptosis of ovarian cancer HO-8910 cell. Cell cycle was controlled in G1/G0.Meanwhile, quercetin could induce upregulation expression of p53 and downregulation expression of Bcl-2, while may be the mechanism of apoptosis of ovarian cancer by quercetin.

　　Key words：quercetin; ovarian cancer; cell proliferation;apoptosis

　　槲皮素(quercetin)是一种天然的黄酮类化合物，广泛分布于多种植物的花、果实、叶中，具有明确的抗感染、抗血小板聚集、抗氧化作用，并影响多种酶的活性。近年来其抗肿瘤作用逐渐为人们所认识并引起广泛的重视[1]。卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其致死率居妇科肿瘤的首位，在药物治疗上主要以化疗药物为主，这些药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会影响正常细胞的代谢，副作用较大，因此有必要寻找副作用小，疗效好，价格低廉的药物治疗卵巢癌，本实验观察了槲皮素对人卵巢癌HO-8910细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨其抗癌机理，为槲皮素应用于临床治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人卵巢癌细胞株HO-8910(中科院上海细胞所提供);槲皮素(Sigma公司)，25 ℃溶于DMSO中;Bcl-2抗体(FITC)及p53抗体(FITC)及同型对照为pharminga公司;胰蛋白酶、RPMI-1640 (华美生物公司);MTT及二甲亚砜DMSO(sigma公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　人卵巢癌HO-8910细胞株，培养基为RPMI-1640内含10%灭活胎牛血清、37 ℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养传代。

　　1.2.2 实验分组

　　共分5组：实验组：加入槲皮素，终浓度分别为10.0 μmol/L，20.0 μmol/L,40.0 μmol/L及80.0 μmol/L组;对照组：加入等量的同型IgG1单克隆抗体。(每组设6个复孔)

　　1.3 实验指标的检测

　　1.3.1 MTT试验

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔200 μL，过夜贴壁后;实验组加入10.0 μmol/L，20.0 μmol/L,40.0 μmol/L及80.0 μmol/L的槲皮素，对照组加等量的同型IgG1单克隆抗体。每组设6 个复孔，继续培养24、48 h后加入MTT(5 mg/mL) 20 μL/孔，4 h后吸净上清液，加入DMSO 20 μL/孔，震荡10 min，用酶标记光仪在波长为560 nm时测定每孔的吸光度(A)值，计算不同浓度抗体对细胞增殖的抑制率[抑制率=(对照组A均值-实验组的A均值) /对照组A均值] [2]。

　　1.3.2 流式细胞仪检测细胞周期

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，按上述浓度培养48 h后，收集细胞，PBS洗涤，制成单细胞悬液，用70%的冰乙醇4 ℃固定12 h，用含核糖核酸酶及碘化丙锭的染液染30 min，上流式细胞仪进行检测。

　　1.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，按上述浓度培养48 h后，收集细胞，用AnnexinV-FITC/PI双标记染色后做流式细胞仪双色分析。

　　1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和p53蛋白表达

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，按上述浓度培养48 h后，收集细胞，70%的冰乙醇4 ℃固定过夜，洗去乙醇，取1×106个细胞加10 mL FITC标记的抗Bcl-2和p53抗体及同型IgG1单克隆抗体，在4 ℃暗处孵育30 min洗去多余单抗。上流式细胞仪获取信息(本实验重复4次)。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量数据均用x±s表示，统计方法采用各组数据两两比较采用方差分析，组间比较采用q检验。P<0.05具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 MTT试验结果

　　实验结果显示：槲皮素对HO-8910细胞的生长具有明显的抑制作用,实验范围内最大抑制率达67.01%，且抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强，呈现剂量、时间依赖性作用,经统计学检验差异具有显著性意义(P<0.01，见表1)。表1 实验组和对照组卵巢癌细胞内的吸光度值和增殖抑制率(略) 注：*每个浓度组与前一浓度组比较P<0.01;△每个时间段与前一时间段比较 P<0.01

　　2.2 槲皮素对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响

　　不同浓度槲皮素作用卵巢癌细胞48 h后，与对照组相比，细胞周期分布、凋亡率均发生改变，即G1/G0期细胞比例数上升，S期和G2/M期下降，细胞凋亡率上升，均有显著差异(P<0.05)，且与槲皮素浓度之间具有剂量依赖性(P<0.05，见表2)。表2 槲皮素对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响(略) 注：*每个浓度组与前一浓度组比较P<0.01

　　2.3 槲皮素对凋亡相关蛋白Bcl-2、p53表达的影响

　　不同浓度槲皮素作用卵巢癌细胞48 h后，与对照组相比，促凋亡蛋白p53表达上调，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降，均有显著差异(P<0.01)，且与槲皮素浓度之间具有剂量依赖性(P<0.01，见表3)。表3 槲皮素对凋亡相关蛋白Bcl-2、p53表达的影响(略)注：*每个浓度组与前一浓度组比较P<0.01

　　3 讨 论

　　槲皮素是一种具有多种生物学活性的黄酮类化合物，广泛分布于被子植物的花叶部分，资源丰富，无毒无味。研究发现槲皮素具有多种药理作用，能抑制人肝癌细胞、人白血病细胞、人淋巴瘤细胞、人宫颈癌细胞等多种肿瘤细胞的生殖生长[3]。但关于槲皮素对卵巢癌细胞作用的研究较少。

　　本实验采用MTT法检测不同剂量的槲皮素对体外培养的HO-8910细胞生长的影响。结果证实槲皮素对HO-8910细胞的增殖具有显著抑制作用，且呈时间、剂量依赖性。本试验结果与张琼的报道一致[4]。

　　流式细胞仪检测细胞周期显示随着槲皮素浓度的增大，G1/G0期比例升高，S期、G2/M期降低，提示槲皮素具有G1/G0期阻滞作用，使进入S期细胞明显减少，阻碍细胞进入DNA合成期。槲皮素阻止卵巢癌细胞周期的进展,说明槲皮素抑制卵巢癌HO-8910细胞增殖可能与其阻滞细胞周期的有序进行有关，从而诱导卵巢癌细胞的调亡。流式细胞仪检测卵巢癌细胞凋亡率亦表明：槲皮素随浓度的增大对HO-8910细胞的凋亡率增大，呈剂量依赖关系，且与对照组比较均具有显著差异(P<0.01)。Bcl-2和p53是重要的凋亡相关蛋白，p53的作用是促进凋亡的发生，而Bcl-2则抑制凋亡[5,6]，因此流式细胞仪的结果提示我们：槲皮素诱导HO-8910细胞可能是通过下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白p53表达而实现的。但诱导凋亡的因素还有很多，有待于进一步研究。

　　总之，本研究发现，槲皮素可以通过使细胞阻滞于G1/G0期，使细胞DNA合成速度降低，细胞周期的循环被抑制而实现对HO-8910细胞的增殖抑制作用;同时可能通过下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白p53表达而诱导HO-8910细胞发生凋亡。本研究为槲皮素应用于卵巢癌的临床治疗提供了实验依据，通过深入研究和进行相关临床实验，有望为卵巢癌治疗寻找一类新药物。

　　【参考文献】

　　[1]Reiterer G, Toborek M, Hennig B.Quercetin protects against linoleic acid-induced porcine endothelial cell dysfunction[J].J Nutr,2004,134(4):771-775.

　　[2]司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司，1996：138.

　　[3]曾文铤，唐武兵，倪宏，等.槲皮素对人肝癌HepG2细胞的作用与机制[J].中西医结合肝病杂志,2003,13(1):17-19.

　　[4]张琼，徐明娟，宋亮，等. 槲皮素对人卵巢癌细胞系增殖的影响 [J].第二军医大学学报,1999,20(6):380-382.

　　[5]Slee EA, O' Connor DJ, Lu X.To die or not to die: how does p53 decide [J].Oncogene,2004，23(16):2809-2818.

　　[6]Sheng H, Shao J, Morrow JD, et al.Modulation of apoptosis and Bcl-2 expression by prostaglandin E2 in human colon cancer cells [J].Cancer Res,1998，58(2):362-366.