超氧化物歧化酶对抗肿瘤药物促宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

作者:刘颖,高超,刘永彪  作者单位：徐州医学院附属医院妇产科，江苏徐州221002;2.徐州医学院附属医院肿瘤科，江苏徐州221002

      【摘要】  目的 探讨超氧化物歧化酶(SOD)对抗肿瘤药物诱导Hela细胞凋亡的影响，并从分子生物学水平探讨SOD作用的可能机制。方法 宫颈癌Hela细胞经顺铂（DDP）、足叶乙甙（VP-16）和阿霉素（ADM）血浆峰浓度不同时间作用后，测定肿瘤细胞内活性氧（ROS）水平、细胞凋亡率及突变型p53和c-fos基因表达的变化，并测定不同时间加入SOD对DDP、ADM、VP-16诱导Hela细胞凋亡及p53、c-fos基因表达的影响。 结果 DDP、ADM不同作用时间对Hela细胞ROS产生状态和细胞凋亡的影响不同， VP-16不刺激Hela细胞产生高浓度ROS。DDP和ADM作用同时加入SOD共同孵育可降低Hela细胞凋亡率(P<0.01)，而DDP和ADM作用24 h后加入SOD对细胞凋亡影响不明显（P＞0.05），而且与p53和c-fos基因表达变化具有一致性。结论 DDP、ADM作用同时给予SOD可抑制药物诱导Hela细胞凋亡，延迟给予SOD不影响Hela细胞凋亡。

【关键词】  超氧化物歧化酶 宫颈癌 细胞凋亡 p53 c-fos

    The effects of superoxide dismutase  on the apoptosis of cervical

    cancer cells induced by antitumor drugs

    LIU Ying1, GAO Chao2， LIU Yong-biao2

    (1Department of Obstetrics and Gynecology, Affliliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu

    221002, China;2.Department of  Oncology, Affliliated Hospital of Xuzhou Medical College)

    Abstract： Objective  To study on a molecular level the effects of SOD on the antitumor drugs-induced  apoptosis of cervical cancer cells. Methods  Hela cell line was treated with 3 mg·L-1 DDP, 0.4 mg·L-1 ADM or  2 mg·L-1 VP-16 for 6, 12, 24 and 48 h. Meanwhile or 24 h later, 316 mg·L-1 SOD was added to the culture to act for 24 h, and then, the intracellular reactive oxygen species (ROS), apoptosis ratio and expressions of mutant p53 and c-fos protein of Hela cells were determined. Results  The production of ROS and the apoptosis of Hella cells increased as the action of DDP and ADM continued within 24 h, but VP-16 failed to produce such effects. The apoptotic rate was decreased when SOD was added to the culture with the drugs simultaneously, the decrement of apoptosis was very evident (P<0.01), but no such effects were noticed if SOD was added 24 h later (P>0.05). The expressions of p53  and c-fos in the present experiment varied similarly to the apoptosis, i.e. decreased only when SOD was added to the culture simultaneously with the antitumor drugs. Conclusion  Application of SOD at different time will have different effects on the DDP or ADM-induced apoptosis of Hella cells in vitro.

    Key words： superoxide dismutase; cervical cancer; apoptosis; p53; c-fos

    宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，严重影响广大妇女的身心健康，通常采用综合治疗。化学治疗的主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡，国外报道抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡与活性氧(ROS)产生增多有密切关系，抗癌剂可使某些肿瘤细胞株ROS产生增多［1-2］ 。超氧化物歧化酶（SOD）是机体内最重要的抗氧剂，可用于临床肿瘤患者放化疗防护。SOD是否影响抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞凋亡目前尚未完全清楚。本研究初步探讨常用抗肿瘤药物诱导Hela细胞凋亡与细胞内ROS水平的关系以及SOD对抗肿瘤药物顺铂（DDP）、阿霉素（ADM）、足叶乙甙（VP-16）诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的影响，并从分子生物学水平探讨其可能机制。

1  材料和方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  细胞株  Hela细胞由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。

    1.1.2  抗肿瘤药  DDP（山东德州制药厂，批号：010902），ADM（浙江海正药业股份有限公司，批号：001204），VP-16（江苏恒瑞制药有限公司，批号：011211）。

    1.1.3  SOD  苏州大学核医学院江家贵教授惠赠，由猪血纯化而得，比活性为5×106 U/g，每支3.5 mg，实验前采用黄嘌呤氧化法测定比活性。

    12  方  法

    12．1  Hela细胞培养  培养液为含10%胎牛血清（FBS）(天津血液研究所)、100 U·ml-1青霉素、0.1 mg·ml-1链霉素的RPMI-1640(GIBCO，USA)，用100 ml培养瓶，置5% CO2、37℃、饱和湿度的恒温箱中培养，细胞达80%～90%融合状态用0.25%胰蛋白酶（上海华美生物工程公司）消化后传代。实验期间不断冻存，全部实验均用指数生长期细胞。

    12.2  DDP、ADM、VP-16处理Hela细胞  细胞生长达70% 融合时更换培养液同时加入药物，DDP、ADM和VP-16终浓度分别为3 mg·L-1、0.4 mg·L-1和2 mg·L-1［3］，然后继续培养，作用时间分别为12、24、48 h，每组6瓶，重复实验3次。

    12.3  SOD处理Hela细胞  将指数生长期的细胞分为4组，对照组：更换培养液继续培养48 h；SOD组：在培养液中加入终浓度为316 mg·L-1 SOD；单纯药物组：3 mg·L-1 DDP、0.4 mg·L-1 ADM；药物+SOD组：加入DDP或ADM同时或加入24 h后再加入终浓度为316 mg·L-1 SOD，继续培养24 h。

    12.4  流式细胞仪（flow cytometry, FCM）测定Hela细胞凋亡  收集上述不同药物、不同作用时间处理后的包括贴壁和悬浮的Hela细胞。以正常人的外周血淋巴细胞为正常二倍体标准，根据测定的DNA组方图，用CELLQUEST分析软件分析Hela细胞的凋亡指数（apoptosis index，AI）和细胞增殖指数（proliferation index, PI）。

    12.5  化学比色法测定Hela细胞ROS产生状态  收集上述各组的Hela细胞在冰水中用电动匀浆器低速匀浆使细胞破碎，离心后取适量上清液进行ROS测定。试剂配制及测定严格按ROS试剂盒说明书进行，现用现配。

    12.6  SP免疫组织化学染色方法检测Hela细胞p53、c-fos基因产物表达  p53、c-fos表达均定位于细胞核，棕黄、黄褐色为阳性表达，结果应用LEICA QWIN计算机图像分析仪比较各组染色强度差异。

    1.3  统计学处理  数据采用x±s表示，组间显著性差异采用t检验。

    2  结  果

    2.1  药物不同作用时间对Hela细胞ROS产生状态和细胞凋亡的影响

    2.1.1  DDP、ADM不同作用时间对Hela细胞ROS产生状态及细胞凋亡的影响  终浓度为血浆峰浓度的DDP、ADM处理Hela细胞，随作用时间延长细胞凋亡增多，ROS水平升高,而且于24 h达高峰浓度，与对照组比较差异显著（P<0.01），24 h后细胞凋亡率继续上升，但细胞ROS水平升高不明显，见表1。

    2.1.2  VP-16不同作用时间对Hela细胞ROS产生状态和细胞凋亡的影响  VP-16作用于Hela细胞，随作用时间延长细胞凋亡率逐渐升高，但细胞内ROS水平无明显变化，与对照组比较无显著差异（P>0.05），结果见表1。表1  DDP、ADM、VP-16对Hela细胞ROS和凋亡的影响

    2.2  SOD对培养Hela细胞增殖和凋亡的影响  对照组PI为32.54±5.38,AI为0.87±0.06;而SOD组的PI为18.26±3.17，AI为1.04±0.13；2组间PI差异显著（P<0.01）,而AI差异不显著（P＞0.05）。

2.3  SOD对DDP、ADM诱导Hela细胞凋亡的影响

    2.3.1  SOD对DDP、ADM诱导Hela细胞凋亡的影响  与单纯用药组相比，同时加DDP和SOD组Hela细胞凋亡率明显降低，2组间差异显著（P<0.01），而DDP作用24 h后加SOD组即SOD（24 h）组Hela细胞凋亡率并不降低，2组间差异不显著（P＞0.05），结果见表2。

    2.3.2  SOD对DDP、ADM处理Hela细胞p53、c-fos基因产物表达的影响  与单纯化疗组相比，同时加入SOD组p53、c-fos光密度明显升高（P<0.05），而DDP、ADM处理Hela细胞24 h加入SOD组p53、c-fos蛋白光密度无明显变化（P>0.05），见表2。表2  SODD对DDP、ADM诱导Hela细胞凋亡及p53、c-fos表达的影响与单纯药物组比较：*P<0.05，**P<0.01

    3  讨  论

    3.1  ROS与抗肿瘤药物诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的关系  目前研究认为巨噬细胞以外的细胞也可产生ROS［4］，当细胞受到物理、化学及生物因素等刺激时，通过细胞生物膜上的NADPH氧化酶系统的作用产生大量的ROS，过量的ROS引起DNA损伤、脂质过氧化而触发凋亡［5］。本组结果显示,血浆峰浓度的DDP和ADM作用于Hela细胞，随着DDP、ADM作用时间的延长，Hela细胞凋亡率逐渐升高，ROS产生增多。表明DDP、ADM均可通过激发Hela细胞产生ROS诱导其凋亡，在一定作用时间内ROS水平与细胞凋亡率有密切关系。而VP-16在血浆峰浓度作用于Hela细胞后，其诱导细胞凋亡的作用也存在时间依赖性，但Hela细胞产生ROS状态并无明显改变，表明VP-16可能并不通过激发Hela细胞产生ROS来诱导细胞凋亡。至于提高VP-16作用浓度是否可刺激Hela细胞产生高浓度的ROS有待进一步研究。

    抗肿瘤药物如何通过ROS介导细胞凋亡可能因药物种类不同而不同，可通过以下多条途径促进细胞凋亡:①ROS可直接作用于细胞DNA使之受损或断裂；②ROS诱导生物大分子发生氧化反应引起结构及构象改变, 通过氧化修饰发挥调控信号转导和对应激作出反应的功能，包括凋亡相关蛋白质的氧化、膜磷脂的氧化修饰；③调节细胞相关基因表达而诱导凋亡，如：p53、bcl-2、c-fos等［6-7］；作为第二信使的ROS的信号传导途径具有细胞种类和刺激因子特异性，不同的细胞生理调节过程所激动的ROS相关的信号分子也不同。由于实验条件的限制，在本研究中仅利用分光光度仪通过化学比色法测定细胞内·OH水平来间接反映O-2和H2O2的水平，未能直接测定Hela细胞内自由基绝对水平，所以抗肿瘤药物刺激Hela细胞产生何种ROS及引起细胞凋亡的绝对ROS水平，这都将是以后继续研究的内容。

    3.2  SOD对抗肿瘤药物诱导Hela细胞凋亡的影响  在生物界为了避免氧化还原状态失衡及DNA损伤，酶类或非酶类的抗氧化系统广泛存在，主要的抗氧化酶包括：SOD、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等。SOD是机体内最重要的抗氧化剂，它能高效率清除超氧自由基（O-2），从而降低由O-2派生出的对细胞损伤更严重的活性产物，如：H2O2、.OH、ROOH等，所以SOD通常被称为一线抗氧化剂。研究表明应用SOD化合物可抑制离体培养肝癌细胞增殖,并诱导细胞内DNA断裂，具有明显的细胞毒性作用［8］。本实验中，在培养液中加入SOD后继续培养Hela细胞，结果显示SOD 可抑制Hela细胞增殖，但不促进凋亡，其可能的原因：①SOD用量不足或作用时间不够；②SOD仅产生细胞增殖抑制作用；③PI 法测定对早期凋亡细胞不敏感。遗憾的是由于各种原因本实验未采用其他实验方法测定早期凋亡细胞，这将有待于今后进一步研究。

    本组结果显示，当向培养基中加入DDP或ADM同时加入SOD共同孵育，Hela细胞凋亡明显减少；表明SOD与DDP、ADM同时处理体外培养Hela细胞可影响抗肿瘤药物的作用，SOD通过迅速清除O-2使Hela细胞不能产生更高浓度的ROS诱导细胞凋亡。而在DDP或ADM处理Hela细胞24 h后再加入SOD，细胞凋亡并不减少，表明DDP或ADM已经刺激Hela细胞产生介导细胞凋亡的信使ROS，再加入SOD后并不影响Hela细胞凋亡，这也进一步证明了DDP、ADM诱导Hela细胞凋亡与细胞内ROS水平增高有关，也将为抗氧化剂在临床防治化疗副损伤方面的广泛应用提供理论依据。

3.3  ROS及SOD对Hela细胞基因表达的影响  免疫组化结果表明抗肿瘤药物DDP、ADM处理Hela细胞可产生更高浓度ROS 下调突变型p53基因和c-fos基因的表达，同时加入SOD共同作用时Hela细胞p53和c-fos蛋白表达增高，而在24 h后加入SOD则无明显变化，这与Hela细胞凋亡变化一致。p53基因是公认的肿瘤抑制基因，大约一半以上的肿瘤细胞中p53发生突变或丢失。p53与细胞凋亡密切相关，其对细胞凋亡的调控是通过抑制细胞的生长来进行的，而ROS可通过影响细胞内大分子的氧化还原状态来调节p53基因 。此外，肿瘤抑制因子P53蛋白对锰超氧化物歧化酶（MnSOD）有负调控作用，MnSOD基因有可能是P53蛋白的作用靶位点，而MnSOD基因已经被认为是一种新型的肿瘤抑制因子［9］。ROS还可引起正常细胞恶性转化过程中细胞的一些癌基因如c-jun和c-fos表达增高，另外野生型p53可抑制c-fos基因的转录。因此认为DDP、ADM诱导Hela细胞凋亡很重要的一方面是通过ROS调节p53和c-fos基因表达水平来实现的。

    总之，多数抗肿瘤药物可通过刺激细胞产生ROS 诱导宫颈癌Hela细胞凋亡，不同时间应用SOD对药物诱导Hela细胞凋亡的影响不同，延迟应用可明显减轻SOD对细胞凋亡的抑制作用，提示我们临床上应用SOD保护机体的化疗损伤应注意使用时间以防影响化疗效果。体外实验的结果可能与机体内结果不完全相同，但可为进一步实验提供理论基础。

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［8］ 肖 良，丁书茂，鲁志松，等.SOD模拟化合物对离体肝癌细胞内DNA的损伤作用［J］.肿瘤防治杂志，2004，11（11）：1130-1132

［9］ Pani G, Bedogni B, Anzevino R, et al. Deregulated manganese superoxide dismutase expression and resistance to oxidative injury in p53-deficient cells［J］. Cancer Res,2000,60(14):3927-3939