2006年秋冬季青岛地区婴幼儿病毒性腹泻病原分析

　　作者：汪照国,弋英,杨婷婷　　作者单位：青岛市疾病预防控制中心，山东 青岛 266033

　　【摘要】目的 了解青岛地区引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原组成及其流行情况。方法 2006年9~12月，采集青岛市儿童医院婴幼儿病毒性腹泻大便样品共38份，采用胶体金法检测轮状病毒;采用RT-PCR法检测星状病毒和人杯状病毒。结果 在38份样品中检测到轮状病毒7份，阳性率为18.42%;检测到星状病毒4份，阳性率为10.53%; 检测到人杯状病毒6份，阳性率为15.79%。其中1份混合感染星状病毒和人杯状病毒，1份混合感染轮状病毒和星状病毒，未发现轮状病毒和人杯状病毒的混合感染。结论 2006年秋冬季，引起青岛地区婴幼儿感染性腹泻的3种主要病毒中，以轮状病毒为主，其次为人杯状病毒和星状病毒。

　　【关键词】 腹泻,婴儿;轮状病毒属;人杯状病毒;星状病毒属

　　AN ETIOLOGICAL ANALYSIS ON VIRAL DIARRHEA IN INFANTS IN QINGDAO IN 2006 WANG ZHAO-GUO, YI YING, YANG TING-TING (Qingdao Disease Control and Prevention Center, Qingdao 266033, China)

　　[ABSTRACT] Objective To investigate the main pathogens and the epidemic of viral diarrhea in infants in Qingdao. Methods Thirty-eight stool samples were collected from diarrhea patients attending Qingdao children’s hospital during Sep. to Dec. of 2006. Rotavirus was detected by colloidal Gold method. Astrovirus and Calicivirus were detected by RT-PCR.Results Among the 38 specimens, seven was Rotavirus positive (18.42%), four were Astrovirus positive (10.53%) and six were Calicivirus positive 15.79%. One sample had mixed infection of Astrovirus and Calicivirus; one’s had mixed infection with Astrovirus and Rotavirus. Conclusion The three main viruses involved in viral diarrhea during autumn and winter of 2006 in Qingdao were Rotavirus, Astrovirus and Calicivirus, in which, Rotavirus placed the first.

　　[KEY WORDS] Diarrhea, infantile; Rotavirus; Calicivirus; Astrovirus

　　小儿腹泻是世界范围内影响儿童健康的常见病，也是引起婴幼儿死亡的一个主要原因[1]。随着抗生素的广泛应用，加之人们生活水平的提高，卫生习惯的改善，细菌性腹泻得到了有效控制。目前，病毒感染腹泻是导致全球儿童急性腹泻的重要原因，这类病毒主要包括轮状病毒、人杯状病毒以及星状病毒，这3种病毒也是世界范围内最为流行的病毒性胃肠炎的主要原因[2]。本研究旨在了解目前青岛地区婴幼儿病毒性腹泻病原谱，掌握其流行现状，为以后加强监测和流行病学调查打好基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　2006年9~12月，收集青岛市儿童医院婴幼儿非细菌性腹泻粪便标本共38份。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物合成 星状病毒检测用引物Mon269、Mon270序列参见文献[3]，扩增片段大小为449 bp;人杯状病毒检测用引物 289、290由国家 CDC肠道病毒实验室提供，诺如属病毒扩增片段大小为319 bp,扎如属病毒扩增片段大小为331 bp，上述引物由上海闪晶生物技术研究所合成。引物序列见表1。 表1 用于PCR扩增的引物序列

　　1.2.2 核酸提取 取少量粪便标本，加入PBS，振荡器混匀，制成体积分数为0.10~0.30的悬液，以12 000 r/min离心10 min，取上清200 μL进行核酸提取，提取试剂盒采用美国Roche公司生产的High Pure Viral RNA Kit，按试剂盒使用说明书提取病毒RNA。

　　1.2.3 轮状病毒检测方法 采用胶体金法进行检测，试剂盒由北京万泰生物药业有限公司生产，批号为20050030，操作按试剂盒说明书进行。

　　1.2.4 星状病毒检测方法 RT-PCR采用日本TaKaRa公司的One step RNA PCR kit (AMV)，反应体系为10×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 10 μL，10 mmol/L dNTPs 5 μL，4×107 U/L Rnase Inhibitor 1 μL，5×106 U/L AMV-Optimized Taq 1 μL，5×106 U/L AMV Reverse Transcriptase XL 1 μL，Mon269和1 μL，Mon270各1 μL，引物反应浓度为0.2 g/L,模板1 μL，补加水到50 μL。RT-PCR条件为42 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，35个循环后72 ℃延伸10 min。取扩增产物6 μL点样于20 g/L琼脂糖凝胶上，电泳20 min，用凝胶成像仪观察电泳结果，观察是否有预期分子质量的条带出现。

　　1.2.5 人杯状病毒检测方法 病毒RNA提取方法同上。RT-PCR检测采用日本TaKaRa公司的One step RNA PCR kit (AMV)，反转录反应体系为10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 4 μL，10 mmol/L dNTPs 5 μL，0.2 g/L 289引物1 μL，5×106U/L AMV Reverse Transcriptase XL 0.35 μL，4×107 U/L Rnase Inhibitor 0.1 μL，RNA模板1.5 μL，补加水到25 μL，反应条件为42 ℃1 h。PCR反应体系为10×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 4 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，0.2 g/L 289引物1 μL，0.1 g/L 290引物1 μL，5×106 U/L AMV-Optimized Taq酶0.4 μL，cDNA 8 μL，补加水到50 μL;反应条件为94 ℃ 3 min;94 ℃ 60 s, 58 ℃ 80 s,72 ℃ 1 min，共30个循环;然后72 ℃延伸10 min。电泳实验同星状病毒检测方法。

　　2 结 果

　　2.1 轮状病毒检测

　　在38份粪便标本中，检测到阳性样本7份，阳性率为18.42%。

　　2.2 星状病毒检测

　　在38份粪便标本中，检测到阳性样本4份，阳性率为10.53%。

　　2.3 人杯状病毒检测

　　在38份粪便标本中，检测到阳性样本6份，阳性率为15.79%。本次实验用289、290简并引物针对RNA多聚酶编码区进行RT-PCR，诺如属病毒扩增片段大小为319 bp,扎如属病毒扩增片段大小为331 bp;由于两者片段相差不大，本实验结果不能将其进行区分，PCR产物经序列测定，带入GenBank中应用Blast功能进行序列在线比对分析，测序结果显示6份PCR产物序列均为诺如病毒RNA聚合酶序列。

　　2.4 混合感染情况

　　在38份粪便标本中，1份混合感染星状病毒和轮状病毒，1份混合感染星状病毒和人杯状病毒，未发现轮状病毒和人杯状病毒的混合感染。

　　粪便样品星状病毒的PCR检测

　　①~④分别为样品9、31、37、39;M为DNA Marker DL2000

　　粪便样品人杯状病毒的PCR检测

　　①~⑥分别为样品3、4、9、25、34、36;M为DNA Marker DL2000

　　3 讨 论

　　近年来，由病毒引起的腹泻病儿越来越多，在2岁以内的婴幼儿腹泻中，半数以上为病毒感染所致，而轮状病毒、星状病毒以及人杯状病毒感染多见于2岁以内的婴幼儿[1]。在我国对轮状病毒感染的研究较多，轮状病毒感染是婴幼儿非细菌性腹泻的主要病原，发展中国家每年约有60万~70万名儿童死于重型轮状病毒腹泻[4~7]。星状病毒是引起急性病毒性胃肠炎仅次于轮状病毒的主要病原之一，其可散发或暴发流行，有明显的季节性[8]。另外，据美国CDC统计，在美国96%的严重非细菌性胃肠炎由人杯状病毒引起。1996年4月~1997年3月，我国首都儿科研究所北京市感染与免疫中心实验室，对1 109例来自首都儿科研究所附属儿童医院门诊及体检血清进行检测，结果表明，人杯状病毒的阳性检出率高达88.8%，这说明人杯状病毒的感染非常普遍。近年来，我国各个省份及地区有关人杯状病毒引起的腹泻时有报道。

　　国内外对上述3种病毒的感染都有不同程度的报道[1,3]。SDIRI-LOULIZI等[1]对632例腹泻儿童进行了多种腹泻病毒的检测，结果显示轮状病毒感染率为22.5%，诺如病毒感染率为17.4%，星状病毒感染率为4.1%。寇晓霞等[3]采用其建立的多重RT-PCR检测3种胃肠炎病毒，对128份临床粪便标本进行检测，结果显示轮状病毒感染率48.44%，诺如病毒的感染率为6.25%，星状病毒的感染率为8.59%。本文结果显示，在38份标本中轮状病毒阳性率为18.42%，星状病毒阳性率为10.53%，人杯状病毒阳性率为15.79%。本实验结果与SDIRI-LOULIZI等[1]报道的结果相比，轮状病毒以及诺如病毒基本一致，但星状病毒较多;与寇晓霞等[3]报道的结果相比，3种病毒都有较大差异。此外，本实验还发现轮状病毒混合星状病毒感染1份;星状病毒混合人杯状病毒感染1份。混合感染是否会加重病情、延长病程等将是进一步关注的问题。

　　本实验只检测了轮状病毒、星状病毒以及人杯状病毒，但引起婴幼儿病毒性腹泻的还有肠道腺病毒，以及肠道病毒中的埃可病毒和柯萨奇病毒等，我们将在以后的工作中对其进行更细致的分类研究。

　　综上所述，青岛地区婴幼儿病毒性腹泻的病原谱比较复杂，在今后的监测工作中应该加强研究，以进一步明确青岛地区病毒性胃肠炎的病原情况，为病毒性胃肠炎的防治工作提供科学依据。

　　【参考文献】

　　[1]SDIRI-LOULIZI K, GHARBI-KHELIFI H, DE ROUGEMONT A, et al. Acute infantile gastroenteritis associated with human enteric viruses in Tunisia[J]. Clin Microbiol, 2008,46(4):1349-1355.

　　[2]MATTY A S, DE WIT, MARION P G, et al. Risk factors for norovirus, Sapporo-like virus, and group a rotavirus gastoenteritis[J]. Emerg Infect Dis, 2003,9(12):1563-1570.

　　[3]寇晓霞,吴清平,王大鹏,等. 多重RT-PCR用于临床检测三种胃肠炎病毒的研究[J]. 微生物学通报, 2007,34(3):401-405.

　　[4]CLASS R I, BRESEE J S, TURCIOS R, et al. Rotavirus vaccines: targeting the developing world[J]. J Infect Dis, 2005,192(Suppl 1):S160-166.

　　[5]KAPIKIAN A Z, HOSHINO Y, CHANOCK R M, et al. Fieldsvirology[M]. 4th ed.Philadelphia:Lippincott-Paven, 2001:1783-1833.

　　[6]WIDDOWSON M A, BRESEE J S, GENTSCH J R, et al. Rotavirus disease and its prevention[J]. Curr Opin Gastroentero, 2005,21(1):26-31.

　　[7]曲梅,杨文,董建红. 秋冬季婴幼儿腹泻206例临床分析[J]. 齐鲁医学杂志, 2004,19(4):347-348.

　　[8]JACQELINE S N, TERRYW LEE, JOHN B K, et al. Typing of Human Astroviruses from clinical isolates by enzyme immunoassay and nucleotide sequencing[J]. Clinical Microbiology, 1995,33(4):797-801.