哮喘患儿的外周血淋巴细胞CD40/CD40L的表达及其与Tc1和Tc2的关系

　　作者：黄花荣， 刘甜甜， 魏菁， 吴葆菁， 檀卫平， 麦贤弟 作者单位：( 中山大学附属第二医院 1. 儿科， 2. 医学研究中心， 广东 广州 510120 )

　　【摘要】【目的】 研究发作期哮喘患儿的外周血CD40、CD40L的表达率及其与Tc1和Tc2的关系。【方法】 应用流式细胞术检测30例哮喘患儿和20例正常对照儿童的外周血淋巴细胞CD40、CD40L的表达率和Tc1、Tc2的细胞数。【结果】 哮喘患儿和正常对照组的外周血淋巴细胞CD40表达率分别为21.59±7.61和15.82±4.44(t=3.376，P< 0.001);CD40L表达率分别为0.20±0.11和0.33±0.12(t=-2.747，P< 0.05);Tc1细胞数分别为9.06±3.80和7.28±3.01(t=0.582，P >0.05);Tc2细胞数分别为7.64±3.67和3.02±1.38(t=3.981，P< 0.001)。CD40和CD40L表达率与Tc1、Tc2数量无显著的相关性(r分别为-0.004和0.231、-0.280和0.186，P >0.05)。【结论】 发作期哮喘患儿存在明显的CD40/CD40L、Tc1/Tc2的异常，这可能与哮喘的发生有重要的关联。

　　【关键词】 哮喘; 白细胞分化抗原40/40配体; 细胞毒性T细胞; 淋巴细胞; 儿童

　　Expression of CD40/CD40L of Lymphocytes and Their Correlation with Tc1 and Tc2

　　Cells in Peripheral Blood in Asthmatic Children

　　HUANG Hua-rong, LIU Tian-tian, WEI Jing, WU Bao-jing, TAN Wei-ping, MAI Xian-di

　　( Department of Pediatrics, The Second Affiliated Hospital, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510120, China )

　　Abstract：【Objective】 To investigate the expression of CD40/CD40L and their correlation with Tc1/Tc2 cells of peripheral blood in children with attack asthma. 【Methods】 The flow cytometry was used to detect the expression of CD40/CD40L and change of Tc1 and Tc2 cells of peripheral blood in 30 children with attack asthma and 20 normal children. 【Results】 The expression levels of CD40 were 21.59±7.61 and 15.82 ±4.44 (t=3.376, P< 0.001), CD40L were 0.20±0.11 and 0.33±0.12 (t=-2.747, P< 0.05) in asthmatic children and the control, respectively. The percentages of Tc1 cells were 9.06±3.80 and 7.28±3.01 (t=0.582, P >0.05), Tc2 cells were 7.64±3.67 and 3.02±1.38 (t=0.582, P< 0.001) in asthmatic children and the control, respectively. There were no significant correlation between the expressions of CD40 or CD40L and the percentage of Tc1 or Tc2 cells ?酌. were -0.004, 0.231, and -0.280, 0.186, respectively; P >0.05). 【Conclusions】 Expression of CD40/CD40L and changes of Tc1/Tc2 cells are significant abnormal of peripheral blood in children with attack asthma, which can contribute to the immune pathogenesis of asthma.

　　Key words：asthma; CD40/CD40L; cytotoxic T cell; lymphocyte; child

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(1): 79-82]

　　小儿哮喘是儿科呼吸道疾病中常见病之一，发病机制仍未能完全明了，其中最主要是免疫异常、气道反应性增强等。在众多实验中发现，发作期哮喘患儿的T、B淋巴细胞功能均有不同程度的异常，而以T细胞功能异常更为关注[1-3]。在免疫反应的起始阶段，T细胞激活需要两个信号： 主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)-抗原肽信号和共刺激信号，如缺乏共刺激分子提供的共刺激信号，T细胞便不能活化，而处于无能状态。CD (cluster of differentiation) 40/CD40L是重要的协同刺激分子，它们在哮喘中的作用如何，以及它们在哮喘免疫发病中与细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell, Tc)的关系如何鲜见报道。我们应用流式细胞术检测哮喘患儿的外周血淋巴细胞的CD40、CD40L表达和Tc1、Tc2细胞数的变化，并探讨它们的关系，以进一步探讨哮喘的发病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　2004年3月~2006年3月，初次发作期哮喘患儿30例随机进入研究组，均为我科住院或哮喘专科门诊的病人，均符合我国的儿童哮喘的诊断标准[4]，其中男性21例，女性9例，年龄为3月~13(4.68±3.40)岁;正常对照组为同期的健康体检者20例，无哮喘及过敏性家族史，其中男性13例，女性7例，年龄为1.3~12(4.95±3.20)岁。两组患儿的年龄分布(t=0.224，P=0.824)及性别构成(?字2=0.138，P=0.710)均无统计学差异。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 主要试剂及仪器 鼠抗人CD40-FITC、CD154(CD40L)-FITC、CD3-TC、CD8-FITC、IFN?酌-PE、IL4-PE、同型阴性对照鼠抗人IgG1-PE和大鼠抗人IgG1-PE均购自BD Pharmingen公司。流式细胞仪FACS Calibur，BD公司产品。

　　1.2.2 CD40、CD40L的检测 采集空腹肝素静脉抗凝血2 mL,密度梯度离心法分离单个核细胞,PBS洗涤,将浓度为1×106/mL单个核细胞以100 ?滋L加入试验管和阴性对照管中,试验管加入荧光标记的单克隆抗体CD3-TC+ CD40-FITC、CD3-TC+ CD40L-FITC，阴性对照管中加入IgG1-PE，用流式细胞仪进行淋巴细胞上CD40/CD40L表达率检测。

　　1.2.3 Tc1、Tc2的检测 取100 ?滋L肝素抗凝血与100 ?滋L RPMI1640混匀后，加入5.0 ?滋L PMA(1 ?滋L/mL)、4 ?滋L Ionomycin(50 ?滋L/mL)、3.4 ?滋l Monensin(0.1 mg/mL)，37 ℃、体积分数5%CO2培养4~6 h。吸出100 ?滋L培养的全血，用做破膜染色QC用。加入20 ?滋L CD3-TC和20 ?滋L CD8-FITC，室温避光15 min后，分成4管(编号A1、A2、A3、A4)，每管加入50 ?滋L已染色的全血;每管加入100 ?滋L Fix Perm中的Regent A液(固定液)，室温避光15 min，加入3 mL PBS，1200 r/min离心5 min，弃去上清;每管中加入100 ?滋L Fix Perm中的Regent B液(破膜液和溶血液)，同时各管中A1加照鼠抗人IgG1-PE，A2加IFN?酌-PE，A3加大鼠抗人IgG1-PE，A4加IL4-PE各5 ?滋L;室温避光15 min，加入3 mL PBS，1 200 r/min离心5 min，弃去上清;0.5 mL PBS重悬细胞，上机检测。

　　1.3 统计学处理

　　定量资料应用均数±标准差(x±s)表示，两组均数比较采用独立t检验。采用Pearson相关系数r进行相关分析。定性资料应用率或比表示，采用?字2检验。所有数据处理均在计算机SPSS10.0软件包进行。

　　2 结 果

　　2.1 哮喘患儿外周血CD40、CD40L的表达

　　哮喘患儿的外周血淋巴细胞CD40表达率明显高于正常对照组(t=3.376，P< 0.001);而CD40L表达率明显低于正常对照组(t=-2.747，P< 0.05;表1;图1-3)。

　　2.2 哮喘患儿的外周血Tc1、Tc2细胞数的变化

　　哮喘患儿的外周血Tc1细胞数高于对照组，但无显著性差异(t=0.582，P >0.05);而Tc2细胞数明显高于对照组(t=3.981，P< 0.001)，差异有统计学意义(表1;图4~8)。

　　2.3 哮喘患儿外周血CD40、CD40L的表达与Tc1、Tc2细胞数的关系

　　CD40、CD40L的表达率与Tc1、Tc2的细胞数无明显相关性(表2)。

　　3 讨 论

　　初始T细胞的完全活化，需要两种活化信号分子的协同作用，第1信号由T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)识别抗原产生，经CD分子将信号转导至细胞内，第2信号(或称协同刺激信号)则由抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)或靶细胞的协同刺激分子与T细胞表面的相应的协同刺激分子受体相互作用而产生。在协同刺激信号的作用下，已活化的抗原特异性T细胞增殖、分化为效应T细胞。目前已知的协同刺激分子有B7/CD28和CD40/CD40L等[5]。已有研究表明：B7/CD28在哮喘中起重要作用[6]，但有关CD40/CD40L在哮喘患儿免疫发病机制中的作用研究较少，且结果不统一。

　　CD40分布广泛，主要表达在B细胞、单核细胞、树突状细胞、成纤维细胞等。CD40L主要由活化的T细胞表达，其中在CD4T细胞的表达明显高于CD8T细胞，而B细胞、NK细胞和单核细胞表面也有少量表达。表达于T细胞表面的CD40L通过CD40对B细胞介导的免疫反应发挥重要的调节作用。如果缺乏刺激信号，则T细胞不能完全活化，而处于无能状态[5,7]。

　　本组资料表明：在哮喘发作期患儿外周血淋巴细胞的CD40表达明显升高，这与国外多项研究的结果一致[8,10]。但CD40L则降低，这提示在哮喘发作期，哮喘患儿T细胞的活化功能或数量是降低的，B细胞活化还存在着其它激发途径，如T、B细胞间其它信号分子和细胞因子的刺激[11]。这些结果提示哮喘患儿存在CD40/CD40L刺激信号传导途径的异常，有可能参与了哮喘的免疫发病。

　　目前已公认，哮喘的发病与Th (help T cell) 2细胞因子分泌过多有关。具有细胞毒作用的T细胞(Tc)同样分为Tc1和Tc2两个亚群，分泌细胞因子类型与Th1细胞类似的Tc细胞称为Tc1细胞，分泌细胞因子类型与Th2细胞类似的Tc细胞称为Tc2细胞。Tc1及Tc2的细胞数在哮喘发作期有何改变，以往研究甚少。

　　本组资料还显示：Tc2明显升高，Tc1虽亦升高，但与对照组比较无显著性意义。这提示哮喘患儿Tc2细胞在哮喘免疫发病中也起关键的作用。另外，我们在既往研究中发现，哮喘患儿外周血IFN-γ水平较正常明显降低，发作期更为明显[1,12]，而本次实验结果显示分泌IFN-γ的Tc1细胞在哮喘发作期较正常对照增多，由此我们推测，哮喘患儿发作期可能存在IFN-γ分泌的障碍，从而导致外周血IFN-γ水平的降低。

　　最近的研究发现，细胞毒性T细胞(Tc)的激发可通过激发树突状细胞(DC)的CD40分子而绕过Th细胞的辅助作用，这对激发体内Tc提供了新的手段[13]。我们分析CD40/CD40L的表达与Tc1、Tc2细胞数的关系，结果提示：哮喘患儿发作期CD40、CD40L表达与Tc1、Tc2细胞数均无明显相关性。这些结果提示CD40、CD40L表达可能与T细胞的活化功能有密切的关联，而与T细胞的数量的多少无明显的关联，从而可能从侧面帮助说明在哮喘发病机制中Th细胞起着关键性的作用。最近有研究认为，CD40和CD40与CD40L的相互作用，参与了黏膜的防御和保护作用[10,14]。

　　因此，在哮喘患儿中，可能存在极其复杂的免疫与免疫调节异常，需要更广泛、更深入的免疫学的研究。本组资料提示：CD40/CD40L的表达和Tc1/Tc2细胞数的异常，可能与哮喘的发生有重要的关联。

　　【参考文献】

　　黄花荣，麦贤弟.哮喘患儿外周血CD25与IFN-γ的水平变化及其相关性研究[J].中山医科大学学报，2002, 23(5)：361-363.

　　麦贤弟，赵 莉，檀卫平，等. 哮喘患儿IL-12、IL-13与IgE水平变化[J].中山医科大学学报，2000，21(5)：400-402.

　　MOCHIZUKI H, SHIGETA M, MORIKAWA A. Development of bronchial hyperresponsiveness during childhood [J]. J Asthma, 2001, 38(1): 1-21.

　　中华医学会儿科学分会呼吸组.儿童支气管哮喘防治常规[J].中华儿科杂志，2004，42(2)：100-106.

　　姚 智. 适应性免疫应答细胞：T淋巴细胞[M]//陈慰峰.医学免疫学，第4版.北京：人民卫生出版社，2004：100-109.

　　AGEA E, FORENZA N, PIATTONI S, et al. Expression of B7 co-stimulatory molecules and CD1a antigen by alveolar macrophages in allergic bronchial asthma [J]. Clin Exp Allergy, 1998, 28 (11): 1359-1367.

　　TAYLOR P A, FRIEDMAN T M, KOMGOLD R, et al. Tolerance induction of alloreactive T cells via ex vivo blockade of the CD40: CD40L costimulatory pathway results in the generation of a potent immune regulatory cell [J]. Blood, 2002, 99 (12): 4601-4609.