新生大鼠脑白质损害时神经胶质细胞凋亡与Fas、caspase3蛋白的表达变化

　　作者：覃琳，熊英，卓平辉，阳倩 作者单位：(四川大学华西第二医院新生儿科，四川成都 610041)

　　【摘要】 目的 探讨Fas、caspase3在新生大鼠脑白质损害时神经胶质细胞凋亡中的作用。方法 实验组和对照组各45只大鼠分别于缺氧缺血后30min、1h、4h、12h、1d、3d、7d、14d及21d处死，免疫组化(SP)法检测Fas、caspase3蛋白表达，TUNEL法测定细胞凋亡。结果 新生大鼠脑白质损害时，细胞凋亡指数在缺氧缺血后4h开始显著增加，3d达到高峰(P<0.05)。对照组未检测到Fas，实验组Fas蛋白在缺氧缺血后30min开始出现，1h增加，12h 达高峰，并持续至3d(P<0.05)。实验组caspase3蛋白表达上调，于缺氧缺血后1d达到高峰，与对照组相比在1h、4h、12h、1d、3d、7d有统计学意义(P<0.05)。结论 新生大鼠脑白质损害时，Fas、caspase3表达及凋亡指数显著增加，并有明显时序性，提示Fas途径激活caspase3后引起的细胞凋亡可能是新生大鼠脑白质损害的发病机制之一。

　　【关键词】 脑白质损害;脑室周围白质软化;Fas;caspase3;凋亡

　　Expression of Fas, caspase3 protein and change of apoptosis　in neonatal rats with white matter damage

　　Qin Lin, Xiong Ying, Zhuo Pinghui, Yang Qian

　　(West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

　　ABSTRACT: Objective To explore the effect of Fas and caspase3 on apoptosis in the white matter damage (WMD) neonatal rats. Methods The pups (45 in each group) were perfused at 30min, 1h, 4h, 12h, 1d, 3d, 7d, 14d, 21d of recovery from hypoxiaischemia (HI). Immunohistochemical technique was applied to investigate the changes in the expression of Fas and caspase3 in periventricular white matter tissues. Apoptotic cells were detected in these tissues by TUNEL. Results Apoptosis index (AI) in the experimental group increased significantly at 4h and reached the peak at 3d after HI. No expression of Fas was found in the control group. The expression of Fas in the experimental group appeared at 30min after HI, increased at 1h, reached the peak at 12h and lasted till 3d. Caspase3 in the experiment group was upregulated, peaked at 1d, demonstrating significant differences at 1h, 4h, 12h, 1d, 3d and 7d compared with the control group (P<0.05). Conclusion In the WMD neonatal rats, the expression of Fas and caspase3 and AI increased significantly in turn, suggesting that the Fas signaling pathway activated caspase3 results in apoptosis may participate in the pathogenesis of WMD.

　　KEY WORDS: white matter damage (WMD); periventricular leukomalacia; Fas; caspase3; apoptosis

　　随着早产儿出生率及存活率的增加,早产儿脑损害的发病率亦逐年增加。脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia, PVL)是早产儿最常见的脑白质损害(white matter damage, WMD)。脑白质的不可逆损害还常常累及脑灰质[1]，从而对中枢神经系统的整体功能造成严重影响，出现痉挛性脑性瘫痪、认知及行为学异常等后遗症。缺氧缺血是PVL最主要的原因。目前研究发现在PVL中存在细胞凋亡，但对其凋亡途径研究较少。本研究在建立2日龄SD大鼠脑白质损害模型的基础上，采用TUNEL法检测脑室周围白质区神经胶质细胞的凋亡情况，免疫组化方法检测凋亡相关蛋白Fas及caspase3的表达变化，以进一步了解脑白质损害神经胶质细胞的凋亡途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物选择及分组 从四川省医学科学院实验动物中心购得清洁级2日龄(P2)SD大鼠12窝，每窝5-15只不等，共104只，体重5.4-8.6g，雌雄不限。将同窝生P2大鼠用抽签法随机分为两组：实验组(缺氧缺血组)57只和对照组(假手术组)47只。

　　1.2 动物模型的建立和标本制备 参照Han等[2]的方法建立新生大鼠脑白质损害模型。将实验组新生鼠麻醉消毒后分离右颈总动脉，双线结扎，中间离断，术后恢复1h后，置于透明的密封箱内，输入6%(体积分数)氧气和94%(体积分数)氮气的混合气体，气体流量2L/min，4h后取出放回常氧母鼠笼中饲养。整个手术及缺氧过程中，保持周围环境温度为30℃以上。对照组仅将缝线从右侧颈总动脉下穿过，不做结扎和缺氧，余同实验组。12只实验组大鼠因不能耐受手术及缺氧而死亡，对照组死亡2只。两组大鼠共90只(实验组和对照组各45只)分别于缺氧缺血后30min、1h、4h、12h、1d、3d、7d、14d和21d处死(每组各时间点5只)。缺氧缺血后不同时间点进行心脏灌注，以4℃ 40g/L多聚甲醛溶液(0.1mol/L PBS配制，pH7.4)100mL灌注固定，开颅取脑，于上述固定液中固定12h，行常规石蜡包埋。自视交叉向后行冠状切开，制成5-6μm的石蜡切片，行苏木素伊红(HE)染色、免疫组化染色和TUNEL染色。

　　1.3 TUNEL染色 使用原位凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)进行检测。石蜡切片常规脱蜡，复水;3%(体积分数)H2O2阻断内源性辣根过氧化酶、PBS洗;微波炉抗原修复15min;胃蛋白酶液(20mg/L溶于Tris/HCL中，pH 7.4-8.0)室温孵育30min、PBS洗;TUNEL反应液在湿盒中37℃孵育60min、PBS洗;即用型转化剂POD在湿盒中37℃孵育30min、PBS洗;DAB底物溶液室温孵育10min、PBS洗;苏木素复染2min;脱水，透明，封片。以细胞核染成棕褐色为阳性。用PBS代替TUNEL反应液作为阴性对照。

　　1.4 免疫组化染色 采用过氧化物酶标记的链霉卵白素生物素试剂盒(SP法)。分别加入Fas(1∶50，武汉博士德公司)、caspas3(1∶200，武汉博士德公司)两种一抗，4℃过夜，常规染色。以胞浆或胞核染成黄色为阳性。用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.5 图像分析 用Leica DM LB2显微镜/Pixera Penguin 150CL数码相机/Viewfinder 3.0图像采集系统采图，Simple PCI8图像分析软件对图像进行分析。每张切片于放大400倍镜下在脑室周围白质区随机选取5个不同的视野采图, 测量阳性细胞的灰度值，求其平均数作为最后的阳性结果。TUNEL结果计算：随机选择5-10个高倍视野(400倍)并计数1000个细胞，记录凋亡细胞数，计算凋亡指数(apoptosis index, AI)，AI=(凋亡细胞数/1000)×100%。

　　1.6 统计学处理 全部结果用均数±标准差表示，采用SPSS12.0统计软件分析。同一组内不同时间点的比较采用单因素方差分析，两组之间同一时间点的比较采用成组设计的两样本均数比较的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 行为改变 新生鼠缺氧缺血中主要表现为全身发绀、躁动不安、四肢强直抽动，缺氧缺血完成后，有反应差、吃奶减少、活动减少、睁眼时间延迟等异常表现。

　　2.2 体重增长改变 缺氧缺血前实验组和对照组体重无差异(P>0.05),缺氧缺血后实验组生长发育较对照组明显落后(表1)。

　　表1 两组大鼠不同日龄的体重比较(略)

　　Table 1 Comparison of body weight in the two groups at different days

　　P2: two days; P5: five days; P9: nine days; P16: sixteen days; P23: twentythree days

　　2.3 组织病理改变(HE染色) 与对照组相比，实验组缺氧缺血后3d脑白质区细胞走行紊乱，组织结构欠清晰，脑室周围白质出现广泛的疏松;14d白质病变加重，右侧侧脑室扩大及胼胝体变薄(图1A)，脑室周围白质可见软化灶，软化灶的周围有小胶质细胞的增生(图1B);21d可见脑白质囊腔形成(图1C)。

　　2.4 脑室周围白质区神经胶质细胞的凋亡 TUNEL法对脑白质进行原位凋亡的测定。阳性细胞的细胞核呈棕黄色，出现黄棕褐色颗粒。对照组在脑室周围白质存在少量细胞凋亡(图2B);与对照组比较，实验组缺氧缺血后4h、12h、1d、3d及7d凋亡细胞数增多，以3d最多(P<0.05，图2A);缺氧缺血后14d两组凋亡细胞数无明显差异(P>0.05，表2)。

　　图1 实验组缺氧缺血后的脑组织病理改变(箭头所指即病变处)(略)

　　Fig.1 Pathologic changes of brain tissue after hypoxiaischemia

　　A: Dilation of right lateral ventricle and thinning of corpus callosum at 14d after hypoxiaischemia (HE×100); B: Periventricular leukomalacia at 14d after hypoxiaischemia (HE×200); C: Capsular space of periventricular white matter at 21d after hypoxiaischemia (HE×100)

　　2.5 脑室周围白质区Fas、caspase3的表达 对照组脑室周围白质几乎无Fas的阳性表达，实验组的Fas于缺氧缺血后30min就有表达，以后开始上升，于12h达到高峰(图2C)，并持续至3d。与对照组比较(图2D)，实验组Fas的表达在30min、1h、4h、12h、1d、3d有统计学意义(P<0.05，表2)。

　　对照组的caspase3在脑室周围白质区有少量表达(图2F)，实验组的Caspase3于缺氧缺血后1h表达开始升高，于1d达到高峰(图2E)，并持续至7d。与对照组比较，实验组Caspase3的表达在1h、4h、12h、1d、3d、7d有统计学意义(P<0.05，表2)。

　　图2 脑室周围白质区神经胶质细胞的凋亡及Fas、caspase3的表达(略)

　　Fig.2 Apoptosis of neurogliocyte and expression of Fas and caspase3 protein in periventricular white matter

　　A: Peak of apoptosis at 3d after hypoxiaischemia (TUNEL×400); B: Cell apoptosis of control group (TUNEL×400); C: The peak expression of Fas at 12h after hypoxiaischemia (SP×400); D: The expression of Fas of control group (SP×400); E: The peak expression of caspase3 at 1d after HI (SP×400); F: The expression of caspase3 of control group (SP×400)

　　表2 两组大鼠各时点凋亡指数、Fas和Caspase3平均灰度值的比较(略)

　　Table 2 Comparison of apoptosis index (AI) and the average gray value of Fas and caspase3 in periventricular white matter in the two groups at different time stages

　　*P<0.05 vs. control group

　　3 讨论

　　Back等[3]研究证实PVL发生于髓鞘形成的高峰期，在人类相当于胎龄为23-32周的时期。Craig等[4]研究显示2-3日龄的新生鼠神经发育是未成熟的，相当于人类胎龄23-32周水平，此期是晚期少突胶质细胞前体占主导地位的时期(占少突胶质细胞的90%)，髓鞘尚未全面合成和沉积，对缺氧缺血等异常呈现高度敏感性，与人类围产期PVL发生的时间窗相一致。因此，本研究选用2日龄SD大鼠，采用Han等的方法建立新生大鼠脑白质损害模型。本实验中动物经缺氧缺血处理后出现相应的临床表现，如活动减少、睁眼时间延迟、体重增长缓慢等现象，病理检查可见缺氧缺血侧脑白质逐渐出现疏松变，白质软化灶，后期发生缺氧缺血侧侧脑室扩大和胼胝体变薄。脑室扩大可能是由于脑髓鞘发育延迟和不足，髓鞘化不足和白质疏松产生脑室壁张力强度的改变。上述白质损害的出现说明新生鼠WMD动物模型制作成功。早产儿PVL是早产儿神经系统后遗症的最常见的原因，其主要有脑白质弥漫性细胞缺失及局限性细胞坏死，其中脑白质弥漫性细胞缺失主要与少突胶质细胞过度凋亡有关[5]。本研究发现WMD时脑室周围白质区神经胶质细胞凋亡在缺氧缺血后4h开始增多，在3d达到高峰，并持续至缺氧缺血后7d，于14d回落至对照组水平，表明WMD时脑室周围白质神经胶质细胞的过度凋亡可能是新生大鼠脑白质损害的发病机制之一。Fas蛋白是一种与细胞凋亡密切相关的I型跨膜糖蛋白。它可与FasL相结合，通过接头蛋白FADD激活caspase8酶原，形成有活性的caspase8，后者可以依次激活其同源酶家族中的其他酶原形成自身激活瀑布，最终激活caspase3，导致细胞凋亡的发生[6]。这一途径被称为死亡受体介导的凋亡途径。Frigerio等[7]的研究发现脑缺血后在神经细胞、胶质细胞、室管膜细胞表面有Fas的高表达，并与凋亡细胞分布一致。我们在实验中发现，对照组中Fas几乎无阳性表达，实验组在缺氧缺血后30min，脑室周围白质中开始出现Fas阳性表达,此后逐渐增强，于缺氧缺血后12h达到高峰，持续至3、7d时降至基线水平。这说明缺氧缺血可诱导新生大鼠脑室周围白质区神经胶质细胞Fas表达上调，从而诱导其凋亡发生。caspases是细胞凋亡中起关键作用的一组半胱氨酸蛋白酶，其中caspase3是介导细胞凋亡的核心蛋白酶[89]。激活的caspase3可以裂解多种底物，包括抑制凋亡的蛋白、caspases酶原、细胞外基质蛋白及骨架蛋白、DNA修复相关分子、与 mRNA 剪切有关的因子和DNA 片段形成因子等，这些底物参于凋亡过程中细胞核、细胞骨架或胞膜结构蛋白的降解，从而导致细胞凋亡[10]。本研究中，实验组大鼠脑室周围白质区在缺氧缺血后1h caspase3蛋白表达开始升高，1d时达到高峰，并持续至7d，提示caspase3可能在缺氧缺血引起的新生大鼠脑白质神经胶质细胞的凋亡中发挥重要作用。本实验结果表明，在新生大鼠脑白质损害时，脑室周围白质区Fas、caspase3和TUNEL阳性细胞增多，并有明显的时序性，即三者表达开始升高的时间分别为缺血缺氧后30min、1h、4h，分别在12h、1d、3d达峰，并分别持续至3、7、7d。这种时序性的表达提示新生大鼠脑白质损害后，脑室周围白质神经胶质细胞经历了Fas表达升高-caspase3激活-细胞凋亡的这样一个过程。由此表明，Fas途径激活caspase3后引起的细胞凋亡可能是新生大鼠脑白质损害的发病机制之一。阐明这一途径的作用，为临床防治早产儿脑白质损害时神经胶质细胞的凋亡提供了实验依据，具有重要的现实意义。

　　【参考文献】

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