胎儿微嵌合体对Graves病动物模型制备的影响

作者：蒲丹，郭辉，马爱群，施秉银    作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院，陕西西安 710061 【摘要】  　　目的 通过分析胎儿微嵌合体对Graves病(GD)动物模型制备的影响，探讨胎儿微嵌合体在产后GD发病中的机制。方法 应用重组人AdTSHR289免疫BABL/c小鼠制备GD模型，随机分组分别配对致妊娠中期或分娩结束后2周。HE 染色行甲状腺组织的病理学检查，Realtime PCR测定甲状腺内Y染色体特异性基因序列SRY。结果 GD动物模型的成功率在单纯免疫组为61.5%，免疫妊娠组为38.5%，免疫生育组为76.9%，三组间存在显著性差异(P<0.05)。SRY基因的检出率在GD妊娠组中为84.6%，在妊娠对照组中为62.5%，两组间存在显著性差异(P<0.05)。分娩结束后2周，SRY在GD生育组中仍有53.8%的检出率，显著高于生育对照组中的12.5%(P<0.05)。并且，甲状腺内SRY基因的相对表达量在GD成模小鼠中较未成模小鼠显著升高(妊娠组：0.82±0.07 vs. 0.34±0.16；生育组：0.58±0.12 vs. 0，P<0.05)。结论 胎儿微嵌合体在BABL/c雌鼠GD成功模型中检出几率较GD未成模者更高，SRY基因的相对表达量更高，提示胎儿微嵌合体可能参与了产后GD的发病。

【关键词】  Graves病 胎儿微嵌合体 动物模型

　　Influence of the fetal microchemirism in the thyroid glandson the Graves disease animal model

　　PU Dan, GUO Hui, MA Aiqun, SHI Binying

　　the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective  To explore the influence of the fetal microchemirism in the thyroid tissue on the Graves disease (GD) animal model. Methods  Mice in experimental group were injected with AdTSH289 (5×108IU) to construct the GD animal model, and when the immunization was over, the experimental group was randomly divided into three parts again: two groups were mated with male mice until two weeks of pregnancy or two weeks postpartum while the other group was simple immunized with AdTSH289 only. SRY was tested by realtime PCR. Thyroid tissue was stained with HE for pathological examination. Results  Histological examination of the thyroid gland revealed that 61.8% of simple immunized mice had goiter, the success rate of GD animal model was 38.5% in pregnancy group, but 76.9% in postpartum groups (P<0.05). The difference in the detection rate of SRY gene between GD pregnant mice and healthy pregnant mice was significant (84.6% vs. 62.5%, P<0.05). And the difference in the detection rate of SRY gene between GD postpartum mice and healthy postpartum mice was also significant (53.8% vs. 12.5%, P<0.05). The relative expression level of SRY gene was higher in successful GD animal model group than in failure GD animal model group (0.82±0.07 vs. 0.34±0.16 in pregnancy groups; 0.58±0.12 vs. 0 in postpartum groups, P<0.05). Conclusion  The detection rate of intrathyroidal fetal microchimerism was more higher in GD model than in failure model. We propose that fetal microchimerism is a candidate mechanism for the modulation of Graves disease in pregnancy and the postpartum period.

　　KEY WORDS: Graves disease; microchimerism; animal model

　　自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease, AITD)主要包括Graves病(Graves disease, GD)、桥本甲状腺炎(Hashimotos thyroidise, HT)和特发性甲减。女性发生AITD的危险是男性的5～10倍，且呈现随年龄增加而增加的趋势。临床中经常看到某些自身免疫性疾病在妊娠时缓解，而在分娩后随即加重的现象，即便是正常孕妇，在产后出现AITD的几率也高达10%左右[1]。对自身免疫性甲状腺炎动物模型的研究表明，雌激素和孕激素可加剧甲状腺炎的程度，睾酮可以减弱、甚至逆转这种刺激作用，因此推测女性激素对AITD的发生有一定影响。但是，妊娠和分娩诱发AITD的机制尚不清楚[1]。在妊娠期，为了保证胚胎不遭受母体的排斥，孕妇的免疫活性受到抑制，而这种生理状况下母体免疫活性的抑制，使得胎儿细胞进入母体、与母体细胞成分形成嵌合状态(即胎儿微嵌合体)成为可能[2]。而在妊娠结束后，母体免疫活性恢复甚至超过原有水平，这时存在于母体组织内的胎儿微嵌合体作为一种异体抗原成分，会象异体移植后慢性移植物抗宿主病(graftversushost disease, GVHD)那样，是产后AITD高发的原因之一吗？这是值得我们思考的问题，因此也就有了本文在此问题上的初步探索。本研究将利用表达TSHR (thyrotropin receptor, TSHR)A亚单位的腺病毒免疫小鼠的方法制备GD动物模型，研究妊娠对GD模型制备的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1 材料

　　PSV2neoTSHR289由美国加州大学医学院CHEN CR教授友情提供。质粒提取和纯化试剂盒购自上海博亚生物技术有限公司；DNA连接试剂盒、限制性内切酶、DNA marker、Taq酶购自日本TaKaRa公司；AdMaxTM Kit D、Adnull购自加拿大Microbix公司；DNA保存液购自天泽基因公司；Realtime PCR试剂盒购自德国APPLICHEM公司；引物合成由上海生工基因技术公司完成。实时荧光定量PCR仪(MyIO)、核酸电泳仪为美国BIORAD公司产品；凝胶成像系统为美国BIOSENS公司产品。    　　114只健康清洁级BABL/c小鼠，6～8周龄，23～28g，由第四军医大学实验动物中心提供。48只雌性用于GD动物模型的制备，24只作为健康对照，42只雄性用于配对。实验动物依据分组不同分笼饲养，饲养条件符合清洁级实验动物的设施标准。

　　1.2 方法

　　1.2.1  表达A亚单位(TSHR289)的重组腺病毒的构建[3]

　　EcoRⅠ和XbaⅠ分别双酶切pSV2neoTSHR289和pUC18，回收867bp目的基因片段，与载体片段连接、转化、筛选得到重组质粒pUC18TSHR289，再用EcoRⅠ+SalⅠ酶切pUC18TSHR289，回收867bp目的基因片段与EcoRⅠ+SalⅠ酶切pDC316后得到的载体片段重组为pDC316TSHR289，测序后大量提质粒。

　　1.2.2  重组腺病毒载体Ad5TSHR289的包装与纯化[3]

　　将重组质粒pDC316TSHR289和重组腺病毒骨架质粒pBHGloxdel E13cre共转染239细胞，收获病变细胞混悬液后，冻融3次，离心，取上清，用DNase酶消化后，用0.45μm的滤膜过滤，阴离子交换柱层析纯化。一次性滤器过滤除菌，得到无菌的纯化病毒，分装保存-70℃冰箱中备用。经典方法测定病毒制品TCID50值，AdTSHR289滴度为2.5×1010IU。

　　1.2.3 动物免疫

　　将72只BALB/c雌鼠随机分为免疫组和正常健康组。免疫组48只，用AdTSHR289 5×108IU/次经胫前注射免疫，每3周1次，共3次。在免疫结束后，死亡小鼠9只，剩余免疫小鼠随机分为3组，各13只。不进行配对称为单纯免疫组；配对至妊娠中期称为免疫妊娠组；配对至生育后2周称免疫生育组。正常健康组共24只，其中8只配对妊娠，8只妊娠生育，8只不加任何干预。免疫组和健康组均按雌雄比例1∶1分笼配对。眼球取血处死小鼠，无菌操作下分离甲状腺，一叶甲状腺以40mL/L甲醛溶液固定；另一叶浸入DNA保存液中备用。

　　1.2.4 甲状腺组织的病理学检查

　　石蜡包埋后，切片作常规HE染色，光学显微镜下观察组织形态学的改变。

　　1.2.5 Realtime PCR测定甲状腺内Y染色体特异性基因序列SRY

　　引物序列根据基因序列库，应用PE APPLIED BIOSYSTEM 设计的引物表达软件设计，具体如下，SRY前引物：5′CCTGAACCCTAAGGCCAACC3′，后引物5′TCCTATGGGAGAACGGCAGA3′；内参照基因βactin前引物：5′CCTGAACCCTAAGGCCAACC3′，后引物：5′TCCTATGGGAGAACGGCAGA3′。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS11.5软件对所得数据进行分析。组间数据以±s表示，各组间的比较采用Independentsamples t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 甲状腺组织的病理学表现

　　光镜下，对照组小鼠见甲状腺滤泡大小较一致，细胞排列比较疏松，上皮细胞呈低立方状或扁平状，滤泡中胶质含量比较丰富(图1A)。成模组小鼠甲状腺滤泡细胞增生肥大，呈立方状或高柱状，滤泡大小不一，滤泡腔中胶质含量减少，在增生的甲状腺滤泡中有乳头状折叠凸入滤泡腔，偶见吸收空泡(图1B)。

　　2.2 妊娠及生育对GD模型制备的影响

　　以上述病理改变为判断GD模型成功的标准，在单纯免疫组(n=13)中8例造模成功，GD成模率为61.5%；免疫妊娠组(n=13)中5例造模成功，GD成模率为38.5%；免疫生育组(n=13)中10例造模成功，GD成模率为76.9%，存在显著性差异(P<0.05)。

　　2.3 GD动物模型中甲状腺内SRY的检出率

　　我们选用小鼠Y染色体上特异性DNA序列SRY为观察指标，检测了GD妊娠组和GD生育组中甲状腺组织内胎儿微嵌合体的存在情况，并与正常妊娠鼠和生育鼠相比较。结果显示，SRY在GD妊娠组中检出率为84.6%(11/13)，在分娩结束后2周，仍有53.8%的检出率(7/13例)；分别较未免疫的妊娠对照组(62.5%，5/8)和生育对照组(12.5%，1/8)的检出率显著增高(P<0.05)。

　　2.4 甲状腺内SRY基因表达水平对GD动物模型的影响

　　在免疫妊娠组中SRY基因阳性的小鼠为11例，其中仅5例成模；免疫生育组7例SRY基因阳性的小鼠中，7例均成模；表现为产后SRY阳性免疫小鼠成模率更高。无论是在GD免疫组还是健康对照组，均表现为妊娠时SRY 基因相对表达量高于分娩后的相对表达量(表1)。比较妊娠时GD免疫组和正常对照组SRY基因的相对表达量，我们发现两组间无显著性差异(P＝0.103)。而GD免疫生育组较正常生育对照组SRY基因的相对表达量显著增加(P<0.05)。比较免疫妊娠组及免疫生育组中GD成模组与未成模组小鼠甲状腺内SPY基因的相对表达量，发现两组均存在成模组中SRY基因的相对表达量显著高于未成模组的现象(P<0.05)。表1  GD动物模型中甲状腺内SRY基因的相对表达量（略）

　　3 讨 论

　　微嵌合体(microchimerism)是指机体内含有少量(每104～105个细胞中少于1)其他个体的细胞或DNA成份。女性在妊娠期间，胎源性细胞(或DNA)进入母体血循环早在妊娠的第4～6周就可发生，并且可以胎儿微嵌合体的形式存在于母体内达20年以上[2]。1988年，SCOTT PEREIRA通过对系统性硬化症患者胎源性微嵌合体的研究，首次提出了微嵌合体与人类自身免疫性疾病相关的观点[4]。动物研究也证实胎儿嵌合体数目与系统性硬化症大鼠模型中皮肤的炎症改变、纤维化和脾肿大程度密切相关[5]。至今，已有多项研究证明了系统性硬化症患者外周血及疾病损伤部位中存在着较对照组更多的胎儿微嵌合体[67]。同样，在对Sjogrens综合征和系统性红斑狼疮的研究中也证实患者体内存在有比对照组更多的胎儿嵌合细胞，甚至有学者还证实这些胎儿嵌合细胞的数目与疾病的严重程度正相关[89]。越来越多的研究正在对胎儿微嵌合体引起免疫异常的机制做深入探讨。那么，胎儿微嵌合体是否也象参与到其他自身免疫性疾病中那样，参与到Graves病这一在妊娠前后有显著变化的自身免疫甲状腺疾病的发病中呢？

　　与人类相比，在动物体内我们可更加细致地了解妊娠和产后不同阶段，胎儿细胞在母体中存在的情况。我们在BALB/c小鼠的实验中也证实，在妊娠中期(鼠配对10～14d)母鼠的甲状腺内就可检测到胎儿细胞DNA成分，并且保持这种细胞嵌合的现象直至产后2周，甚至更长时间。胎儿嵌合体在母体内产生和存在的机制还不很明确，但胎盘组织可能在母体的免疫耐受方面起重要作用[1014]，如：HLA G可拟制NK细胞介导的细胞免疫；Fas配体参与母体妊娠过程中T细胞克隆的缺失或隐蔽，使得母体对胎儿微嵌合体的抗原性不做应答；只在胎盘细胞中表达的Indoleamine 2、3二氧化酶可分解母体胎盘区域免疫细胞中的色氨酸，在鼠类中已证实与妊娠的成功非常重要。胎盘所发挥的免疫调节作用会导致妊娠和分娩后母体免疫状态的改变，包括CD+4/CD+8T细胞亚群比例的下调，这种下调甚至可保持到产后6月；也包括一些细胞因子的变化，如在妊娠中利于Th2细胞反应的因子增多，而在分娩后利于Th1细胞的反应。免疫系统在妊娠过程中发生的这些剧烈变化维持了正常的妊娠，也使得胎儿细胞进入母体循环并定居于母体的某一组织成分中。    　　在本实验的GD动物模型制备中，我们同样发现妊娠对GD模型的制备有着直接的影响。在给予同等剂量的AdhTSHR A亚单位和同样的方法免疫BABL/c小鼠后，如果辅以配对妊娠，则GD模型的成功率较单纯免疫显著增加。并且，我们进一步利用Real time PCR的方法，检测了妊娠和产后GD模型甲状腺中Y染色体α亚单位特异性DNA序列SRY基因的存在情况，也证实成模小鼠的甲状腺内SRY基因相对表达量较未成模者更多。近期，KIARASH等[16]学者用GFP(绿色荧光蛋白)转基因雄鼠与同品系雌鼠交配后，在妊娠的不同时期检测雌鼠不同组织中GFP存在情况，结果发现，正常鼠在妊娠的各个时期内，多种组织中都会有GFP阳性嵌合细胞的存在，但一经分娩，嵌合细胞数目迅速下降而不被检出。我们的实验结果却提示，在GD模型鼠甲状腺内，直到分娩后2周，SRY的检出率仍高达53.8%，只是SRY基因相对表达量较妊娠时减少；而正常对照鼠分娩后SRY的检出率仅12.5%。这就进一步提示，胎儿微嵌合体的确与产后GD的发生存在着某种内在联系。但具体是通过何种机制改变甲状腺内的免疫状态还需进一步的研究。

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