可溶性Netrin-1受体对人滋养细胞株TEV-1增殖凋亡的影响

可溶性受体广泛存在于细胞外液中,作为相应膜受体的竞争者与配体进行结合,阻断配体信号的转导途径,影响细胞生物行为,在炎症发生、肿瘤血管形成等过程中起到重要作用。Necgenlll作为一种特异与Ne疝卜1结合的膜受体,广泛分布于机体神经、肌肉及上皮组织。当细胞外Nctrin-1占据跨膜蛋白胞外FC段的特异结合部位形成Netrin1/Neonin结合物后,通过Nctrin1/Nenin通路进行信号传导,激活肌动蛋白,聚合呈纤丝状,使细胞膜生出丝状伪足样并延伸,参与神经、肌肉及腺体形成。同时研究还发现,Neenin可作为前凋亡囚子诱导细胞凋亡H。杨昀等囵研究表明Nethn-1表达于滋养细胞,但Netrin-1/Neellh通路是否介导滋养细胞凋亡过程仍有待研究。因此,我们通过可溶性Netrin-1受体,即人重组蛋白Neoge血n胞外FC段:结合游离Netrin-1,检测细胞增殖、凋亡的行为变化,探究Net⒒n-1/Neogcnin通路在滋细胞的悬浮液,1500〃min离心5血n,弃上清液收集细养细胞生物学行为中的功能。

1材料和方法

1.1材料人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1由香港大学George SWao博士惠赠,此细胞系来源早孕绒毛膜绒毛,具有绒毛外滋养细胞的免疫学和生物学表型田。人重组蛋白Ncon血胞外FC段,DMEM/F12细胞培养基、新生牛血清、二甲基亚砜(DMS0)、噻唑蓝(M×美国⒍bco公司),兔抗人Netrin-1单克隆抗体及sABC邛ITC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),AmcxinV_ΠTC凋亡检测试剂盒(珠海健康元生物医药有限公司),T1izd试剂(美国In说№gen公司),Reve1·Tra Ace及SYBR GⅡen Kal丬ime PCR ma哎cr mix试剂盒(日本Toyobo公司),hghtcyder荧光鲳0PCR扩增仪(德国Roclle公司),SDS-PAGE凝胶试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司)。Netril11特异性引物的核苷酸序列如下:正义链:5′-TGGGGCG-GTTGTCCTA唧C-3′,反义链:5′_GCCTTGTTGCTTG-GCGTGT-3′;β_actlll特异性引物的核苷酸序列如下:5′-G叨℃CG叩ACACCC唧CTTG-3′,丿叉义链:5′-CT-GCTGTCACCTTCACCGT-3′;以上序列均由上海生工生物I程技术服务有限公司合成。

1.2方法将TEV-1细胞置于含15%新生牛血清的DMEM/F12培养液中,37℃、5%CO2培养,待细胞培养至对数生长期时,用0.z~s%胰酶消化液解离。预处理细胞:按5×1σ个/孑L接种于96孔板上,每孔体积⒛0【tl,培养以h至细胞完全贴壁。改用含不同浓度(0、1、5、10、5Ol√ml)的Neogenin无血清培养液,其中不含Necl叩nin(即0ng/ml)的培养液为对照组,添加浓度1、5、10、50ng/llll的Neo胛nh培养液组为实验组。

1.3 Mm比色法检测测定不同浓度Neogenin对TEV1细胞增殖的影响。两组培养液根据不同药物浓度再分设3孔,并置于37℃、5%CO2的培养箱中zh,弃培养液,各孔加人⒛淤Mm,37℃孵育4h,弃上清液,再加人150淤DMS0温和振荡10血n使结晶充分溶解、混匀,酶标仪(波长⒆0nm)测定各孔吸光度。

1.4流式细胞术(FCM)检测测定NegC而n对TEV1细胞凋亡的影响。预处理时改用6孔板,以1×106个/孑L细胞接种得到不同浓度Neo。oc血n干预勿h后的TEV-1细胞,0.01M PBS缓冲液洗涤1次,胰酶消化液解离各孔细胞,15O0〃min离心5血n,弃上清液收集细胞,0.01M PBS缓冲液重新悬浮细胞并计数。取含2×10个细胞的悬浮液,1500〃min离心5血n,弃上清液收集细胞,依次加人1×结合缓冲液(Billding Buffer)5O0淤、膜联蛋白V(Ame虹nV)5耐及碘化丙啶(PI)1QlLl,轻轻混匀。在室温下避光反应10血n,30血n后用流式细胞仪检测,激发波长488nm,发射波长53Ollm,通过捕捉到All nαhV、PI发出的荧光组成细胞直方图,每个象限的点数及其占丿总点数的百分比即表示每种细胞的数目及所占细胞的百分比。在细胞直方图内的左上象限(Q1)、右上象限(Q.)、右下象限(Q3)及左下象限(Q4)分别代表损伤细胞、正常细胞、早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞,其中总凋亡率为早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞之和占所有细胞的百分比(o+Q4)。

1.5细胞免疫荧光检测检测TEV-1细胞表达情况。预处理时改用叨孔板,以104个/孔细胞接种得到不同浓度N∞gC而后的TEV-1细胞,弃培养基,0.0IM PBs缓冲液洗涤2次,3血Ⅳ次;4%多聚甲醛固定细胞15血n,0.01M PBS缓冲液洗涤4次,3血次。加人0.1%聚乙二醇辛基苯基醚150l作用血n,o.01M PBS缓冲液洗涤2次,3而ll/次。加入正常血清(1:10)封闭⒛而n后甩干,兔抗人Netril11单克隆抗体(1:100)4℃过夜,0.01M PBS缓冲液洗涤2次,3mw次。各孔加人与兔抗人Netrin-1单克隆抗体相对应的生物素化鼠抗兔吒G二抗(1∶10,置37℃叵温箱30而n后用0.01M PBS缓冲液洗涤3次。滴加用异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素复合体(1:100),置37℃叵温箱30血n后甩干,再加入PI 5.0ug/ml。20mh后用001M PBS缓冲液洗涤5次,4血ly次。置于荧光显微镜下以蓝光(波长488nm)激发后观察。

1.6 rca1△me PCR检测检TEV—I细胞Netrin-1 mRNA表达情况。同FCM处理。采用氯仿一异丙醇一步法提取细胞丿总RNA,按试剂盒说明将mRNA逆转录成cDNA分子,应用SYBR Grccn染料技术行实时定量PCR反应。扩增条件:首轮变性2min;变性95℃×15s、退火72℃昭Os、延伸”℃泓5s,末轮延伸”℃×10血n,婀个循环。样本扩增和数据的获得采用Rclche荧光定量PCR仪,得到各浓度标本的曲线,分析α值。TEV-1细胞Netril11mRNA表达值(待测目的基因起始拷贝数/内对照基因起始拷贝数)待测样品;△Ct=Ct待测样品-△Ct正常对照。

1.7 We呲em印迹检测同FCM处理。采用全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白质,行宝CA法田测定蛋白浓度,各孔加人总蛋白质⒛飓,经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至聚偏氟乙烯膜上,分别加人兔抗人Netrin-1单克隆抗体(1:300)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(120O),4℃孵育过夜。次日加人用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔坨G(⒈3O00)或辣根过氧化物酶标记的培G进行化学发光反应,结果曝光于医用X线胶片上。将胶片进行扫描,用凝胶图像分析系统处理图片条带光密度值(代表Netrin-1蛋白表达情况)。1.8统计学处理采用SP℃12.0统计软件,实验数据用厉+s表示,均数间比较采用F检验。

2结果

2.1不同浓度Neo黟nh对TEV丬细胞增殖的影响经不同浓度NeogCnh培养扭h后,实验组TEV-1细胞吸光度依次为0.娲+O.∝、0.笳+O。ω、0.”+O.01及0.31+0.O3,与对照组的0。⒛+O,01比较差异无统计学意义(P).05),说明Neogenin的浓度对TEV-1细胞增殖无明显影响。

2.2不同浓度Neo罗nh对△Ⅳ-1细胞凋亡的影响经不同浓度Neclgen血培养以h后,实验组TEV丬细胞总凋亡率依次为、(38±4)%、(39。笏±9.40)%及(56.b~s±9.83)%。可见,1细胞凋亡率随Neogenin浓度的增加而增高,与对照组[(18.⒛+O.85)%]比较差异有统计学意义。

2.3 TEV1细胞表达情况细胞免疫荧光检测表明,TEV-1细胞的细胞膜及细胞质内出现黄绿色荧光(图),细胞核被PI着色后呈现棕黄色荧光。未见其它明显非特异性荧光反应。

2.4 TEV-1细胞Ne“n~1mRNA表达情况Ⅱd丬ime PCR检测发现,经不同浓度Neogenin培养TEV-1细胞24h后,实验组细胞表达Netrin-1mRNA水平较对照组有明显增加,其增加倍数依次为1.89+±0.30、1.56±0.笏、40.38±9.32。两组比较差异有统计学意义(P<0.O5)。

2.5 TEV-1细胞Netrin-1蛋白表达情况Wcstcm印迹检测结果显示,经不同浓度Neogenin培养TEV-1细胞γh后,实验组Netril11蛋白表达量依次为0.83±0.01、0.84±0.032廴0.92±0.04,上又寸且虿组0.79±0.01比较未见明显增加,差异无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

在探究神经发育过程中的未知蛋白时,Vielmettcr等学者于19%年通过提取孕18d的鸡胚脑组织建立DNA文库并对其进行研究,发现一种新物质一Neenin,属结肠、直肠癌缺失基因家族成员,细胞外含有4个免疫球蛋白结构域、6个FN3区域及与Nctrin1特异结合的部位Ncon广泛表达于脊椎动物胚胎神经、上皮及肌肉组织中,参与细胞分化、迁移及增殖等过程。作为胚胎神经前体细胞的特异性标记物,Neon讪还参与细胞的分化过程,并且与特异性结合后促进神经新生及轴突形成Ⅱ封。Necn血极性表达于成腔上皮细胞膜上,与相邻细胞特异性受体Netrin-1结合后通过Nctrin-1/Neo姿而n通路诱导上皮细胞定向迁移、极性生长并互相黏附,从而形成完整的上皮结构等判学者研究发现,与其它VEGF、PDGF等有丝分裂原一样,Nen-1是一类具有较强促进血管新生作用的蛋白。它通过刺激内皮细胞增殖,诱导其迁移并黏附于血管平滑肌细胞,参与新生血管网络的构建。研究还发现,Netrin-1可促进脐带内皮细胞增殖及管腔形成Ⅱ习。本研究改用不同浓度的Neogn忆培养液干预zh后,具有绒毛外滋养细胞特性的TEV-1细胞Netrit11 mRNA表达量有所升高;当实验组Necl留血n的浓度达到5Ollg/ml时,Ncthn1mRNA水平较对照组增加碉。38倍,两组间差异有统计学意义(P<0.O5)。

另外,TEV1细胞虽然能表达Netrin-1蛋白,但受Neo扩nh的浓度影响不明显,具体机制仍有待进一步研究。体内存在的可溶性受体通常为膜受体的胞外段经水解释放的。目前,研究者常通过基因重组技术获得具有可溶性受体特性的人重组蛋白,作为相应膜受体的竞争者与配体进行结合,阻断配体的信号转导,影响细胞生物行为,在机体生命活动中起到重要作用。本研究发现,TEV-1细胞能表达Netrin-1蛋白起到维持细胞生长的作用。当培养基中Netrin-1与游离蛋白Neo图nin胞外Fc段结合后,培养基中游离Netril11的浓度下降,使得TEV-1细胞的Nethn1/Nnin通路信号传导减弱,并通过反馈机制促进Netrin⊥1转录及翻译,最终导致Ne缸1mRNA及Netrin-1蛋白水平升高。但由于Netrin-1蛋白表达升高不显著,且被培养基中Neogenh部分中和,TEV细胞未受到足够Nctrin1蛋白的刺激,导致细胞凋亡率增加。TEV-1细胞增殖情况无明显改变可能与滋养细胞分泌其它细胞因子有关,具体机制仍有待于进一步研究。综上所述,可溶性Netrin-1受体能促进TEV-1细胞凋亡及Ndhn~1mRNA表达,Netrin-1/Neogel血通路参与了TEV-1细胞凋亡调节过程。