蜕皮甾酮对大鼠蛛网膜下隙出血后大脑皮质损伤的影响

蛛网膜下隙出血(subarachnoid kmoˉ hage, SAH)是一种常见的神经系统急危重症,年发病率为 5-⒛/I0万,近30年来发病率呈上升趋势[1],给家庭、社会带来沉重负担[2’ 3],探讨SAH后脑损伤机制及有效的药物治疗成为急需解决的问题。蜕皮甾酮 (ecψster。ne,EDS)是一种天然甾体化合物,是中药牛膝、祁州漏芦等的活性成分[4]。具有改善微循环、改善血液流变学、抗氧化及细胞保护、降低毛细血管通透性、增强机体免疫功能和调节血管舒缩等多种功效[57]。本实验建立非开颅大鼠SAH模型,应用蜕皮甾酮干预,通过检测脑含水量、免疫组化检测Bcl-2, Caspase名,TUNEL检测神经细胞凋亡探讨蜕皮甾酮在蛛网膜下隙出血后脑损伤治疗中的保护作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

手术显微镜(Ms-2)购自德国Leica公司,显微照相系统购自日本公司,蜕皮甾酮购自中国科学院昆明植物研究所,TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒、Bcl-2抗体、caspase-3抗体及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物工程有限公司。

1.2 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠60 只,体重300-350g,随机分为3组,每组20只:假手术组,除不刺破动脉外其余操作与建立sAH模型步骤一致;SAH组,刺破颈内动脉分叉部建立SAH模型[:];EDs干预组,制各 SAH模型同时给予腹腔内注射EDS液⒛ mg/kg,12 h后再次给药一次。

1.3 脑含水量测定

实验后24h将各组10只大鼠断头处死,迅速取脑,滤纸吸去表面血液和水分,取左侧大脑皮层脑组织一块,分析天平称湿重后置试管内,放入80 ℃恒温干燥箱内,烘烤至恒重(二次重量差≤0.2 mg),取出称干重。Elliott公式计算脑组织含水量 (%)。脑含水量=(湿重一干重)/湿重×100%[9]。

1,4 病理学标本制作与观察

术后以h将各组10只大鼠麻醉,迅速开胸暴露心脏,经左心室快速灌注生理盐水和4%多聚甲醛,断头取脑。取下的脑组织标本置于4%多聚甲醛中固定6h再依次放人⒛%,⒛%的蔗糖溶液中, 待脑组织下沉后石蜡切片行HE染色,光学显微镜下观察并拍片。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡率

石蜡切片常规脱蜡至水,3%H202甲醇阻断内源性过氧化物酶10mh,PBS漂洗,按每张切片取末端脱氧核糖核酸转移酶(Terlninal deoxnucleotidyl transferase,TDT)和地高辛标记的dUTP(I,IG-dUPT) 各1u,加人181tl标记缓冲液中,混匀。吸弃切片上多余液体后加标记液⒛ ul/片,样本置于温盒中, 37℃ 标记2h。PBs液漂洗,加封闭液,室温封闭30 mh,生物素化抗地高辛抗体滴加标本片,置于温盒中37℃ 过夜;PBS液漂洗,DAB显色,苏木素复染, 脱水,透明,中性树胶封片。阴性对照TUNEL反应液中不加TdT,其余反应同前。随机选取大脑皮质中4个非重叠硐0倍视野,计数凋亡神经细胞数和神经细胞总数,细胞凋亡率=凋亡细胞勤/细胞总数×100%。

1.6 免疫组化检测Bcl-2 、caspase-3表达变化

石蜡切片常规脱蜡至水,严格按照ABC试剂盒说明书,抗原修复,山羊血清封闭,滴加⒈⒛0的一抗稀释液,4℃ 冰箱中孵育过夜;PBs漂洗3次,滴加1△ OO生物素标记二抗,孵育1h,DAB显色,脱水,透明,中性树胶封片,显微镜下观察并照相。以 PBs缓冲液代替一抗作为阴性对照,阳性对照片购自北京中杉金桥生物工程有限公司。Bcl-2 、caspase-3蛋白灰度值分析方法:免疫组织化学染色切片参照文献辨认皮层。以阳性对照片为参照。阳性神经元细胞胞质中可见棕黄色颗粒,否则为阴性。采用美国⒊mpPCI图像处理与分析系统进行灰度值分析,测定阳性染色细胞的灰度值,各实验组取相对应切面观察,在每张切片取4个非重叠佃0倍视野, 每个视野测量的像素量保持一致,分别测其平均密度值,以上测量值减去相应背景测量值后的平均值为最终灰度值。 J shanxi Med Univ, ADr2013, Ⅴo144No4 1.7 统计学处理各组数据采用死±s表示,应用SPSS12,0统计软件进行统计学处理,各组数据采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑含水量测定结果假手术组皮层含水量为(78.37±0.53)%;与假手术组比较,SAH组脑含水量明显增加,皮层含水量(80.37±0,58)%,差异有统计学意义(P< 0,05);EDS治疗组脑含水量(79.09 ±1.“ )%,与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05),与 SAH组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 HE染色观察结果 HE染色后在普通光镜下观察可见假手术组大脑皮质神经细胞边缘清晰,无水肿变性,胞核呈圆形或椭圆形,染色质在核内分布均匀,核仁清晰;SAH 组皮质神经细胞边缘欠清楚,细胞水肿变性,细胞体积增大,胞质稀疏淡染,部分细胞核固缩,核周间隙增宽,部分神经细胞染色不均、核深染、凝集;EDS干预组上述病理变化均有改善。

2.3 TUNEL检测细胞凋亡假手术组TUlXTEL染色后可见皮层神经细胞着色浅,基本为透明样,偶见棕褐色、缩小成不同形状的细胞,零散可见染色质核膜下聚集成新月形、分叶状改变,凋亡小体少见(图2,见第3⒛ 页),神经细胞凋亡率为(4.1± 0.sg)%;SAH组见部分神经细胞明显缩小,形状各异,着色深,胞核内可见深染的棕褐色颗粒,部分细胞可见染色质核膜下聚集成新月形、分叶状改变,部分细胞可见凋亡小体,核固缩、深染(图2, 见第3z页),凋亡率为(26.5± 3.“ )%,与假手术组比较有统计学意义(P<0.01);EDS干预组神经细胞凋亡较SAH组减少,小部分神经细胞核边聚、固缩或染色不均或呈分叶状改变,凋亡小体较少(凋亡率为(7.8± 1.⒓ )%,与假手术组比较差异无统计学意义(P>0,“ ),与SAH组比较,差异有统计学意义(P<0,01)。

2,4 Bcl-2 、caspase-3表达变化

大脑皮质神经细胞可见Bcl-2表达,部分细胞胞质内可见棕黄色颗粒的阳性细胞,量多,SAH组表达减少,差异有统计学意义(P(0,01),EDS组表达较SAH组多,但少于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。caspase-3在假手术组少量表达, SAH组明显增加,差异有统计学意义(P<0,01)

3 讨论

蛛网膜下隙出血是一种常见的神经系统危急重症,但其具体机制尚不明确,预防和治疗效果也不理想。蜕皮甾酮(是天然甾体化合物, 吴旭等在大鼠肺水肿实验中发现EDS具有改善肺通透性、减轻脂质过氧化反应、减轻肺水肿的作用;在大鼠急性脑损伤模型中应用EDS干预发现,EDs能通过减轻脂质过氧化反应减轻脑水肿,改善脑缺血[10]。以往研究发现在蛛网膜下隙出血后2h即有脑水肿的发生[11],本研究结果显示大鼠SAH后2h 脑含水量明显增加,应用EDs干预后大鼠脑含水量明显减轻,与吴旭等应用EDs在大鼠急性脑损伤的模型中对抗急性脑水肿结果一致,这说明蜕皮甾酮能减轻SAH引起的脑水肿。凋亡是神经细胞死亡的重要形式。本研究结果显示SAH可导致大脑皮质凋亡神经元数量明显增多,应用EDS干预可明显减轻神经元凋亡,说明神经细胞凋亡是SAH后早期脑损伤的一种重要机制,而EDS可通过抑制神经元凋亡而起到神经保护作用。调控凋亡的相关基因通常分为两大类,抗凋亡基因与促凋亡基因。Bcl-2 家族为目前发现的最重要的抗凋亡基因蛋白,Bcl-2是一个含有239个氨基酸残基的蛋白质,能稳定线粒体外膜,是目前已知的主要抗凋亡基因,其抗凋亡主要是通过防止线粒体细胞色素C的释放,阻断Caspase的活性和调节钙通道等抑制细胞死亡。CⅡpase为一种促凋亡基因蛋白,在细胞凋亡的蛋白酶级联切割反应的进程中处于核心位置[13],活化的Caspase名通过降解细胞骨架、蛋白激酶、转录因子等各种底物最终引起细胞凋亡。本研究发现假手术组Bcl9蛋白表达明显,sAH组表达最少,而Caspase名在假手术组中仅少量表达,SAH后明显增加,应用EDS干预大鼠皮层神经细胞Bc” 蛋白表达增加,Caspase-s表达减少,说明EDS可能通过促进Bc” 表达,抑制 Caspase名表达从而抑制神经细胞凋亡,减轻SAH 后大脑皮质损伤。总之,蜕皮甾酮作为中药的主要活性成分,具有多靶点的作用特点,能减轻sAH后早期脑水肿、并通过拮抗神经细胞凋亡保护sAH后大脑皮质损伤, 在蛛网膜下隙出血后脑损伤治疗中有良好的应用前景。但单一的蜕皮甾酮不能完全阻断其损伤过程, 对SAH后的早期损伤机制应进一步深人研究,临床上对早期蛛网膜下隙出血的患者应采取综合的治疗措施,才有可能得到最满意的治疗效果。

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[收稿日期: 2012-12-20 ]