控制性超促排卵后不同卵巢反应对体外受精妇女妊娠结局的影响

控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimula- tion, COH)的应用是体外受精一胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)技术的重要环节，合理的COH方案对于获得足够数量的高质量卵子至关重要，卵巢对COH的适度反应也是后续治疗的重要基础。尽管近年来COH方案不断更新，仍然存在一些问题，如出现卵巢反应不良或过度反应等。卵巢低反应易导致周期取消及妊娠率下降‘一;卵巢高反应易出现卵巢过度刺激综合征(ovarian hypers- timulation syndrome,OHSS)等近期并发症，严重者可危及生命〔z7。虽然有不少临床及实验室技术可以预测卵巢对COH的反应性，但目前除年龄和窦卵泡计数(antral follicle count , AFC)外，仍缺乏明确、有效的指标。患者的个体差异、生理功能改变以及病理状态均可导致卵巢对COH反应异常目前对卵巢高反应和低反应还缺乏统一的判断标准，发生机制不明确，也缺少有效的方法扭转卵巢对COH的异常反应，这些都是人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology ,ART)领域有待解决的问题。 成功着床除了需要高质量的卵子和胚胎外，合适的内膜准备对获得和维持妊娠也十分重要。子宫内膜是雌激素和孕激素作用最直接的靶器官，合适的雌/孕激素比例是刺激着床前子宫内膜呈可接受状态的重要因素。雌激素在子宫内膜容受性(endo- metrial receptivity , ER)的建立中起重要的调节作用，可刺激内膜增殖，加强子宫和内膜的血流灌注等〔3。 COH过程中，子宫内膜在卵泡期暴露于超生理剂量的幽体激素中，可能导致黄体早期内膜激素受体表达的改变，取卵时也已观察到内膜的组织学发育提前[5]从而影响ER建立。然而，目前对刺激周期的着床期内膜状况知之甚少，仅估计着床窗(w_ndow for implantation, WOI)在促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)峰后的5一10 d'`6} o 在刺激周期中，尽管随着获得的卵子增多，可移植的胚胎也增加，但高反应者的胚胎种植率仅为 5%一10%，显著低于正常反应者的10%一20% }''$〕和自然周期的30% `9}。并且，刺激周期中多余的胚胎，行冻融胚胎移植后的种植率与正常反应者相近甚至更高，提示新鲜周期的种植率下降并非与胚胎质量有关，而可能是ER受损所致[s,lo川。然而，目前对雌二醇(estradiol, EZ)水平是否会影响IVF妊娠结局的观点尚不一致，也有研究〔12,13〕认为COH不影响 IV F妊娠结局。此外，对于Ez作用于ER的确切机制尚不明确。针对上述问题，本研究通过分析COH后不同卵巢反应对IVF-ET妊娠结局的影响，探讨不损伤ER的血清峰值E:的适度范围。

1.对象与方法

1. 1研究对象 以2008年1月一2009年12月在上海交通大学医学院附属仁济医院因输卵管和(或)男性因素进行第一周期体外受精/卵胞质内单精子注射一胚胎移植(in vitro fertilization/ intracytoplasmic sperm injection- embryo transfer,IVF/ICSI-ET)治疗的不孕妇女为研究对象，共1 310例。纳人标准:年龄20 } 39岁;体质量指数正常;月经规律;基础卵泡刺激素(follicle- stimulating hormone , FSH ) < 10 IU/L;未进行过卵巢手术;;B超监测证实排卵功能和子宫腔形态正常;纳入研究前3个月内未使用过激素类药物。排除标准:合并子宫内膜异位症、输卵管积水;合并多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome , PCOS )、高催乳素血症、甲状腺和肾上腺等其他内分泌疾病。

所有研究对象根据COH周期中人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)日血清 E2质量浓度，按百分位0%一10% ,11%一25% ,26% 75 % ,76%一90% ,91%一100%将卵巢反应程度分为低反应组(A组)、低中反应组(B组)、中反应组 (C组)、中高反应组(D组)和高反应组(E组)。并发OHSS者按Golan分类系统诊断[14]

1.2 COH方案 根据患者特征采用标准的长方案、短方案及微束」激方案，COH药物使用促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agoniat，GnRHa) (0. 1 mg/支，辉凌，德国)/促性腺激素(gonadotropin, Gn)(75 IU/支，默克雪兰诺，瑞士;50 IU/支，欧加农，荷兰;75 IU/支，丽珠，中国)。长方案多用于卵巢功能较好的患者，在排卵后第7天开始皮下注射GnRHa 0. 05 mg/d ,直至月经第3天血清Ez和FSH检测结果证实已出现垂体降调节，然后剂量减为0.025 mg/d, 同时加用Gn 2一3支/d，随卵泡发育调整Gn用量，直至卵泡成熟。短方案用于卵巢功能轻度下降患者，GnRHa (0. 1 mg/d)从月经第2天开始使用，月经第3天开始使用Gn，余同长方案。微刺激方案主要用于AFC较少(超声下双侧卵巢AFC < 5个)的患者，月经第3天单独使用Gn ( 75 IU/支，丽珠，中国) 1一2支/d促排卵，部分患者在最大卵泡达14 mm时加用促性腺激素释放激素拮抗剂(gonadotropin-releasing hormone antagonist, GnRH} ) ( 0. 25 mg/支，默克雪兰诺，瑞士)1支/d，至卵泡成熟。 COH期间应用多普勒超声(SSD-1400 , Aloka，一口本)监测卵泡大小、内膜厚度及形态等指标。同时，在B超检测同日上午10;00前抽取静脉血3 mL，采用化学发光法(Immulife 1000 , Simens，德国)测定血清Ez等激素浓度。当有1个卵泡达18 mm和(或) 2个卵泡达17 mm，且14 mm以上的卵泡数与血清F, 值相当时，注射5 000一10 000 IU的hCG(2 000 IU/支，丽珠，中国)。

1. 3 IVF-ET过程 hCG注射后34 } 36 h在阴道超声引导下穿刺取卵，按常规进行配子处理、胚胎培养和胚胎移植。使用含40 IU/mL肝素的磷酸缓冲液(PBS)冲洗卵泡，采用人类输卵管液(human tubal fluid, HTF)进行捡卵、受精和胚胎培养。IVF者在取卵后4一6h后加人经处理的精子，ICSI者在取卵后2一4h后行ICSI 操作。16 } 18 h后观察受精情况，出现双原核和双极体者为正常受精。受精卵继续培养1一2d，根据卵裂球数目、大小、形态和无核碎片比例进行胚胎质量评估分级，A和B级为优质胚胎。取卵后2一3d 进行胚胎移植，< 35岁者最多移植2个胚胎，妻35 岁者最多移植3个胚胎。胚胎移植后第14天检测血 p-hCG，阳性者2周后行B超检查，见孕囊和胎心搏动者确定为临床妊娠。

1. 4统计学分析 采用SPSS 13. 0软件进行统计学分析。计量资料采用无士、和最小值一最大值表示，组间比较采用单因素方差分析;计数资料以百分比表示，组间比较采用厂检验。P < 0. 05表示差异有统计学意义。

2结果

2. 1患者临床特征和IVF结局 所有患者中，原发不孕875例，继发不孕435例; 接受IV F者586例，接受ICSI者724例;临床妊娠率为44. 73 070，着床率为30. 05 %，流产率为3. 73% o 患者临床特征和IVF结局见表I}

2. 2各组患者临床特征比较 A,B,C,D,E组hCG注射日E，质量浓度范围分别为5583.60 pg/mL} A组患者年龄最高，与其他各组比较差异均有统计学意义(P <0.01) ;D组年龄最低，与A,B,E组比较差异也均有统计学意义(P<0.05)o A组的不孕年限显著高于其他各组(P <0.01)。基础FSH值从A组到E组呈递减趋势，其中D组和E组均显著低于A 组和B组(P<0.01)} Gn用药时间从A组到E组呈递增趋势，C,D,E组均显著高于A,B组(P<0.01)0 Gn用量从D组到E组呈递减趋势，其中D,E组均显著低于B,C组(P <0. O1) } hCG注射日血清E2质量浓度在各组间比较，差异均有统计学意义(P<0.01)0 hCG注射日内膜厚度在各组间比较，差异均无统计学意义(P >0.05)o C组周期取消率最低，D组和 E组的周期取消率高于B组(P < 0. 05尸<0.01)和C组(P<0. O1 ,P<0. O 1)(表2)。

2. 3各组卵子和胚胎发育情况比较 从入组到E组，获卵数、}'I II卵数、受精卵数和卵裂数逐渐递增，组间差异均有统计学意义(尸< 0. O 1)从、组到E组优质胚胎数呈递增趋势，除D 组和E组间差异无统计学意义外，其余各组之问的差异均有统计学意义(P<0.01)。优质胚胎率呈递减趋势，其中C组、D组和F组显著低于A组和K组 (P<0.01)}组、I)组和E组平均移植胚胎数显著低于B组和C组(P < 0. 01)(表3)。

2. 4各组妊娠结局的比较 A一C乡R.妊娠率和着床率递增，C一F组妊娠率和着床率递减。A组的妊娠率和着床率均最低，其次为E组。A组妊娠率显著低于B,C,D组(P <0.01), 着床率显著低于C组(P <0.01 );C组妊娠率和着床率均显著高于A组(P <0.01,P <0.01)和E组 (P<0.O1,P<0.05)各组间流产率比较差异尤统计学意义(P>0.05)(表4)

3讨论

COH推动了TV F技术的发展，然而COH过程中伴随多个卵泡发育成熟，导致血清E，水平高于自然周期的数倍甚至数十倍。高水平E,除了增加诱发 OHSS的风险，对IVF妊娠结局还会产生何种影响，目前还存在不同看法。

本研究选择的研究对象排除f高龄、子宫内膜异位症、输卵管积水、反复种植失败、子官疾病等影响卵子质量和ER的疾病，可以较为可靠地评估各组卵子和胚胎质量的差异，分析血清E。水平对卵子质量和妊娠结局的影响。

3. 1卵巢反应和卵子发育的相关性及其影响因素 卵巢反应除受年龄和卵巢功能影响外，患者的生理和病理状态也!‘分重要。本研究显小:A组(卵巢低反应组)患者的年龄和基础FSH最高，提示高龄和卵巢功能下降者的卵巢反应性降低。E组(高反应组)患者年龄又有所上升，并目_虽然用药时间较长，但用药剂量最低，提示除了年龄和外源性Gn构成刺激卵巢高反应的重要因素外，其他因素如患者个体体质对Gn敏感性的差异一也不可忽视从A组到E组，随卵巢反应增强，OHSS发牛率呈递增趋势，提示高Ez水平有增加OHSS发病的风险在COH 周期开始时即有大量窦卵泡的患者，当这些卵泡被刺激产生过度生理功能时易发生0日SS。周期取消率在卵巢高反应组最高，其次为中高反应组和低反应组，在卵巢中反应组最低。这主要是山于治疗前考虑到高反应组需预防OHSS，以及与低反应组获卵数少导致可移植胚胎数降低有关。

激素的适当使用和准确监测对于IV F技术十分重要。一些研究一‘s〕报道，随血清Ez水平升高，获卵数也相应增加，最终妊娠率也得到提高，两者间存在正相关。然而，另一些研究’3j显示血清E，水平与 IVF结局无关或呈负相关，这可能与不同研究选择的患者存在差异、对于卵巢反应的定义不同、不同生殖中心检测Ez的方法不同致其水平存在较大差异有关。

人类卵母细胞和卵丘细胞都存在雌激素受体 (ER-。和ER-日)〔‘6，雌激素受体的多态性可能预测卵巢反应性「‘7〕。雌激素可影响卵子胞质成熟，而黄体酮( progesterone , PQ)则促进卵子减数分裂的恢复〔‘8〕。卵子体外培养实验显示:E:可直接影响成熟中卵子的质量，诱导GV期卵子胞质成熟，特征表现为细胞内游离C a2+浓度的快速升高，伴随一系列的 C a2十震荡培养液中加人的E:可作用于卵子表面影响胞质成熟，提高IVF后的受精率和卵裂率〔‘9〕。还有报道~zo.z}」显ius，卵巢低反应者在标准COH方案前一周期进行黄体期EZ补充可增加获卵数和优质胚胎数，并获得更好的奸娠结局。 1999年，有学者观察了ICSI治疗周期的卵子形态和胚胎质量，发现 hCG日血清Ez水平高者产生质量更好的卵子和胚胎，认为hCG日血清Ez水平可以作为胚胎质量的预测指标〔zz7。然而，木研究结果与其不同，从A组到E组，尽管随血清FZ水平升高，获卵数、Mn卵数、受精卵数、卵裂数和优质胚胎数呈递增趋势，但优质胚胎率则呈递减趋势，提示过高的血清E,水平可能损害卵子受精后胚胎的发育潜能近年亦有研究23认为COH可影响胚胎质量。

3. 2血清E,水平与LVF妊娠结局的相关性 本研究中，由于选择的患者总体条件较好，获得了较高的临床妊娠率(44. 73 % )。本研究显示:C组 (卵巢中反应组)的妊娠率和着床率均最高，hCG注射日血清E,水平在4 2I3 pg/mI以下时，患者的临床妊娠率和种植率随血清E,水平上升而升高，但超过该水平后则开始下降，该结果与Jo。等’5〕的研究结果相同。有研究一24,25〕认为高E，水平者往往伴随高 P,水平，单纯E2不能反映黄素化状况，因此采用hCG 日P}/E2比值观察卵巢正常反应和高反应的IVF妊娠结局，但未发现该比值与妊娠结局有关。还有研究〔2e观察到高峰值E,水平及黄体中期E2快速下降影响种植率。这些研究均提示并不是获卵数越多奸娠率就越高，在获卵数和妊娠率之间需要确立一种平衡关系，以免影响E P}和着床率。

本研究中高反应组的优质胚胎率下降，且移植优质胚胎后的妊娠率和着床率一也低于除卵巢低反应组的其他各组，提示卵巢低反应和高反应均不利于 IV`F妊娠结局，低反应可能因获卵数少致可移植胚胎数下降，而高反应则可能通过影响ER而降低IVF妊娠率。

3. 3高水平E2降低IVF妊娠率的作用机制

成功妊娠取决于胚胎和母体环境之间精确的相互作用。在自然周期，子宫内膜在卵巢IVF-ET的COH过程中，卵子和子宫内膜长时间暴露于高雌激素环境，可使内膜组织学变化与生理不符，腺体发育和间质发育的同步性发生改变，内膜种植窗开放与胚胎发育不同步，或子宫内膜的激素受体表达异常，从而影响ER和妊娠率.

小鼠模型研究川显示:一个狭窄范围的血清Ez 水平就可能决定WOI的开放，并且其开放时间在给予低剂量EZ时得以延续，而E,升高时则迅速关闭.COH可能改变E, /P、比值，影响内膜发育，使}'OI的开放发生偏移。Haouzi等‘32’采用基因芯片技术检测了同一患者自然周期和刺激周期中黄体早期和黄体中期内膜的基因表达状况，发现虽然不同周期内膜从接受前到接受态的转变类似，但激素刺激改变 ER，导致一些生理功能如转化生长因子(transformin g growth factor, TGF)信号、自细胞迁移和细胞周期发生缺陷;因此，建议取消新鲜胚胎移植，进行自然周期冻融胚胎移植。近年研究[;s显示COH方案对ER 有影响，全基因分析发现刺激周期中一些内膜趋化因子和生长因子表达改变，并且GnRH、较GnRHa方- 案更近似于自然周期。此外，取卵时机械抽吸掉部分颗粒细胞可影响黄体功能而降低妊娠率

总之，COH刺激疗法已普遍应用于IV-F治疗中，但其并发症尤其是OHSS影响卵子质量，导致胚胎与子宫内膜发育不同步，成为阻碍IVF妊娠率提高的重要原因。理想的IVF妊娠结局需要适宜的血清E, 水平，卵巢低反应和高反应均不利于IVF妊娠结局，低反应可能因获卵数少导致可移植胚胎数下降，而高反应则可能通过影响ER及降低优质胚胎率而降低IVF妊娠率。针一对同一人群采用标准化的相同力- 案，进行不同卵巢反应对IV F妊娠结局的研究，可以得出更细致的结论。

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