自发性高血压大鼠心肌组织microRNA-133a与TGF-β1蛋白表达的改变及意义

高血压是常见的心血管疾病,能导致心肌纤维化、心肌肥厚等心脏病理生理改变,从而引起心力衰竭、心律失常等不良预后。微小核糖核酸(miRNA)是内源性非编码的小分子RNA,通过调控基因表达广泛参与生命进程及疾病发生发展[1-2]。目前研究表明,miRNAs在心肌纤维化、心肌肥厚等心血管疾病的病理生理过程中具有重要的调控作用[3-6]。转化生长因子β1(TGF-β1)是公认的促纤维化细胞因子,能诱导胶原、蛋白聚糖等细胞外间质(ECM)成分合成,从而促进心肌纤维化[7-8]。研究表明,在尼古丁诱导的犬心房成纤维细胞,microRNA-133a(miR-133a)表达受抑制,导致TGF-β1蛋白表达上调伴随大量胶原合成,miR-133a能通过调节TGF-β1蛋白表达参与成纤维细胞胶原合成[9]。但是目前在高血压病中,miR-133a与TGF-β1蛋白表达关系的研究报道较少。本文通过检测自发性高血压大鼠(SHR)心肌组织中的miR-133a与TGF-β1蛋白表达水平,对二者在高血压引起的心肌纤维化中关系进行探讨。

材料和方法

1  材料

1.1  实验对象  14周龄的雄性SHR和Wiskar-Kyoto(WKY)大鼠各12只,体质量220-24Og,购自北京维通利华生物公司,许可证编号为SCXK(京)2006-0009。

1.2  材料与设备  TGF-β1小鼠单克隆抗体(R&D);辣根过氧化物酶结合的马抗鼠Ⅱ抗、ABC试剂盒禾口DAB试剂盒(Vector);Trizol试剂(Invitrogen);miScript Reverse Transcription Kit、miR-133a引物和U6内参照(Qiagen);蛋白裂解液(西安晶彩公司);Western blotting羊抗鼠Ⅱ抗、β-actin内参照(Jackson)。动物恒温系统和无创血压测量分析系统(上海奥尔科博公司);石蜡切片机(Leica);光学显微镜(Nikon);PCR仪(Bio-Rad);电泳仪、电泳槽(北京六一仪器厂)。

2  方法

2.1  大鼠血压测量  用无创测压法测大鼠尾动脉压,在大鼠安静清醒状态下测量血压。恒温系统加热至39℃,使尾动脉出现明显的搏动波,尾袖气囊充气阻断尾动脉搏动波,缓慢放气测量血压,反复测3次。观察4周,SHR血压持续明显升高,WKY大鼠血压正常作为正常对照,2组均在18周龄时取心脏标本。

2.2  大鼠心脏标本处理  称量大鼠体质量,10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,取出心脏,在冰生理盐水中清洗血液,无菌滤纸吸干水分,减去心房组织和右心室游离壁,电子天平称取左心室重量。左室重量指数(LVWI)=左心室重量(mg)/体质量(g)。垂直于心室长轴,在中点处将左心室横切成两半,心尖部用4%多聚甲醛固定8h,乙醇梯度脱水后石蜡包埋,做形态学检测;心底部放入冻存管,-8O℃超低温冰箱储存,行分子生物学检测。

2.3  大鼠心肌组织Masson染色及观察  作心肌组织石蜡切片(厚5um),常规脱蜡后行Masson胶原染色。光学显微镜下观察心肌组织胶原改变。通过NIS-Elements图像软件摄取照片,并测定胶原面积在视野中所占面积百分比。每张切片选5个不含血管和瘢痕组织视野,测量心肌胶原容积分数[CVF(%)=心肌胶原面积/所测视野面积×100%];每张切片任选3支小动脉,测量血管周围胶原面积比率(PVCA=小动脉周围胶原面积/小动脉管腔面积)。

2.4  免疫组化法检测心肌组织TGF-βl蛋白表达  切片脱蜡后80℃抗原热修复20min,3%H202消除内源性过氧化物酶;封闭2h,加TGF-βl小鼠单克隆抗体(1:50),4℃孵育过夜;辣根过氧化物酶结合的马抗鼠Ⅱ抗(1∶400),室温孵育2h;ABC工作液孵育2h,DAB法显色,脱水后封片。光学显微镜下观察,组织中棕黄色颗粒为阳性染色,每个组织切片取5个视野拍照,通过NIS-ElementsBR3.OO图像分析系统对结果进行半定量分析,阳性面积占组织切片面积的比例为阳性数值。

2.5  Western blotting法检测心肌组织TGF-βl蛋白水平  提取心肌组织总蛋白,Bradford法进行蛋白质定量;10%SDS-PAGE胶电泳分离蛋白质,转膜;封闭1h,TGF-β1小鼠单克隆抗体(1:10OO0)4℃孵育过夜;羊抗鼠Ⅱ抗(1:2OO0)室温孵育1h;显色显影定影,扫描胶片,用图像分析软件Image-Pro Plus6.0对图像进行灰度分析。

2.6  实时荧光定量PCR(qPCR)检测心肌组织miR-133a表达

取100mg大鼠心脏组织,Trizol试剂盒提取心肌总RNA;逆转录合成cDNA,逆转录反应体系:miScript  HiF1ex Buffer 2uL,Nucleics Mix 1uL,miScript Reverse Transcriptase Mix 1 uL,总RNA6uL,混匀后短暂离心,37℃反应1h,95℃水浴5min,将得到的cDNA置于-20℃保存各用。

3  统计学处理

采用SPSS13.0软件对数据进行统计分析,数据以均数±标准差(mean±SD)表示。两组间均数比较采用莎检验,变量间的相关分析采用Pearson直线相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1 大鼠一般资料

与对照组比较,SHR组尾动脉收缩压和舒张压明显升高(P<0.01),LVWI明显增大(P<0.05),见表1。

2 大鼠心肌组织Masson染色结果

对照组可见红色心肌细胞排列整齐紧密,细胞间隙散在少量蓝色胶原纤维,SHR组心肌细胞排列紊乱,细胞间隙增宽,可见大量蓝色胶原纤维沉积,见图I。对心肌胶原纤维定量分析显示,SHR组的CVF和PVCA较对照组明显升高(P<0.01),见表1。

3  大鼠心肌组织TGF-β1蛋白表达改变

免疫组化检测显示,TGF-β1主要在成纤维细胞表达,分布在细胞膜、胞浆及细胞间隙,对照组心肌有少量TGF-βl表达,SHR组心肌可见TGF-β1大量表达,见图2。Westerm bltting检测显示,SHR组心肌TGF-βl蛋白表达水平显著高于对照组(1.21±0.14vs0.65±0.07,P<0.01),见图3

4  大鼠心肌组织miR-133a表达

miR-133a的熔解曲线均为单峰状,表明PCR产物无污染、引物二聚体和假阳性,引物特异性良好,见图4:Real-time qPCR结果显示,SHR组心肌miR-133a表达水平较对照组明显降低(P<0.01),SHR组心肌miR-133a表达水平为对照组的(23.6±4.5)%。

5  大鼠心肌组织miR-133a与TGF-βI蛋白表达水平相关性分析

Pearson直线相关分析显示,SHR组心肌组织miR-133a表达水平与TGF-β1蛋白表达水平呈显著负相关(r=-0.791,P<0.01)。

讨论

高血压、心肌梗死等多种心血管疾病均可导致心肌细胞外间质增生、胶原沉积,从而引起心脏结构功能异常[10]。TGF-β是公认的具有重要作用的促纤维化细胞因子,TGRβl能通过自分泌和旁分泌,作用于成纤维细胞,诱导其表型改变,使胶原合成能力显著提高[7-8]。

miRNA是内源性非编码蛋白质的小分子RNA,主要功能是通过调控基因表达广泛参与生命进程及疾病发生发展[11]。miR-133a是肌肉特异性miRNA,在心肌含量丰富,研究显示,double-miR-133a基因敲除小鼠的心脏发生严重的心肌纤维化,并最终因心力衰竭死亡,表明miR-133a在心肌细胞间质合成平衡中具有关键作用[12]。在心肌梗死病人及主动脉缩窄动物模型中,心肌miR-133表达水平均出现明显降低[13-14]。研究表明,体外培养的心房成纤维细胞在尼古丁刺激下,miR-133a表达水平下调了60%-7O%,并导致TGF-βl蛋白水平显著升高,伴随大量胶原合成;miRNA TargetScan系统分析显示miR-133a与TGF-βlmRNA的3’-URT有多个可能的结合位点;心房成纤维细胞miR-133的过表达,可以明显减少TGF-βI蛋白表达和胶原合成,这一作用可以被而R-133的反义寡核苷酸(AM0-133)抵消[9]。但是在高血压病中miR-133a与TGF-β1的表达关系目前尚未见研究报道。

本研究发现,18周龄SHR出现了明显的心肌纤维化,Masson染色可见SHR心肌细胞间隙和血管周围有大量胶原纤维沉积,CVF及PVCA均较对照组明显升高。免疫组化检测显示SHR心肌合成大量TGF-β1,在细胞膜、胞浆内及细胞间隙均有表达,表明TGF-β1作为分泌蛋白发挥促纤维化作用。进一步采用Westen boltting法进行蛋白定量发现,SHR心肌TGF-β1蛋白水平较对照组升高了1倍左右。Real-timeqPCR检测显示,SHR心肌miR-133a表达水平显著降低,为对照组水平的四分之一左右,血R-133a水平与TGRβ1蛋白水平呈显著负相关。

本实验表明,血R-133a在SHR心肌中表达降低,可能对TGF-β1的抑制作用减弱,导致TGF-β1蛋白合成增加,引起心肌纤维化。是否能通过调节而R-133a的表达,增强对TGF¨β1蛋白表达的抑制作用,从而改善高血压病的心肌纤维化有待进一步研究。