Runx3蛋白在肠易激综合征大鼠模型中的表达

作者               作者单位

孙晓宁     海南省人民医院消化内科，海南 海口　570311

谭　琰     海南医学院附属医院消化内科，海南 海口　570102

安　钰     宁夏医科大学消化内科，宁夏 银川　750004

孙　晔　   宁夏医科大学消化内科，宁夏 银川　750004

[ABSTRACT] Objective： To observe the expression of Runx3 protein in rat model with irritable bowel syndrome (IBS) and to investigate the inhibiting effect of Runx3 in the development of cancer. Methods： IBS rat models were induced by intracolonic instillation of acid or restraint stress methods， healthy control were also assigned. After visceral sensitivity of all three groups was detected， the expression of Runx3 protein was detected and compared by immunohistochemistry. Results： The contraction frequency of the abdominal muscle in two model groups was significantly enhanced as compared with that of the control group (P〈0.05). No sign of inflammation was observed in any group. The expression of Runx3 protein in was detected in all groups without showing significant differences among each other (P〉0.05). Conclusions： Influence of Runx3 protein in the progress of IBS needs father study.

[KEY WORDS] Runx3 protein; Irritable bowel syndrome; Rat model; Immunohistochemistry

肠易激综合征(irritable bowel syndrome， IBS)是一种病因和发病机制尚不明确的功能性肠道疾病。临床以腹痛、腹胀伴排便习惯和大便性状改变为特征，其发病是多种因素综合作用，最终导致内脏动力和内脏感觉异常。近年来研究发现，部分IBS患者存在炎症或免疫功能的异常改变，但其确切的发病机制尚不清楚[1]。Runx3是一种新的肿瘤抑制基因，新近研究发现其在免疫细胞(尤其是在T淋巴细胞和树突状细胞)发育过程中发挥重要作用[2,3]。国外有研究报道，Runx3基因敲除小鼠出现肠道自发性炎症，表现为Th1细胞和Th2细胞的混合性炎症改变，但前者为主[4]。本研究目的是了解Runx3蛋白在IBS大鼠模型肠黏膜组织中的表达情况，初步探讨其在IBS发病机制中的作用。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　实验动物及分组

体重为(200±5)g 的成年雄性Wistar大鼠75只，购自湖南疾病预防控制中心，实验动物生产许可证号：SYXK(湘)2003-0002。整个实验操作过程均饲养于标准的Ⅱ级动物房。适应性饲养1周后随机分为3组：IBS1组：乙酸灌肠+束缚应激组;IBS2组：单纯束缚应激组;正常对照组，每组25只。

1.1.2　主要试剂及仪器

兔抗大鼠Runx3多克隆抗体上海天呈公司提供， PV-6001两步法检测试剂盒和DAB显色试剂盒均由北京中衫公司提供。RM6280C型多道生理信号采集处理系统和针型插入型电极均由成都仪器厂提供。8F导尿管(直径2 mm，球囊最大容量3 mL，最大直径2 cm)用作结直肠内球囊扩张导管(浙江康康医疗器械有限公司生产)。

1.2　实验方法

1.2.1　大鼠模型制备

IBS1组：实验前24 h禁食，不禁水，乙醚麻醉后经肛门插入连接注射器的硅胶管(距肛门8 cm)，结肠内灌入40 mL/L的乙酸1 mL，缓慢拔出硅胶管，用手压迫肛门并将大鼠尾巴抬高30 s，然后用0.01 mol/LPBS 1 mL冲洗结肠，放回笼中饲养14 d;IBS2组：按照Williams方法[5]行束缚应激，束缚前禁食24 h，不禁水，乙醚麻醉后，用宽胶带束缚前肩、前上肢及胸部，限制前上肢搔抓头面部，但不限制其活动，束缚时间为1 h(自大鼠清醒后开始计时),7 d。正常对照组：不做任何处理。

1.2.2　腹壁肌电活动评估肠道敏感性测定[6]

大鼠实验前24 h禁食不禁水，3%戊巴比妥钠腹腔注射(1 mL/kg)麻醉下，将涂石蜡油带气囊8F导尿管插入结肠内(使气囊末端插入肛门内7.0 cm，在肛门外1.0 cm处将其固定在大鼠尾根部)后，大鼠固定在手术台上，将银丝双极电极插入腹股沟韧带上方、剧中线1.5 cm一侧腹外斜肌上，待大鼠适应30 min后，每只大鼠给予球囊扩张3次，容量分别为1.0、1.5、2.0 mL，每次扩张持续5 min，间隔30 s(以防肠道缺血)，记录5 min内腹外斜肌收缩次数。肌电活动增高超过基线水平100 μV以上为一次有意义腹部收缩活动。

1.2.3　组织形态学检查

肌电活动测定结束后，给予过量麻醉药将大鼠处死，分别取横结肠、降结肠及直肠组织各一块，10%中性福尔马林固定，显微镜下观察肠黏膜病理组织学改变。

1.2.4　Runx3蛋白免疫组化检测

常规脱腊至水化，3%的H2O210 min，蒸馏水洗3次各3 min，一抗(1∶400),4 ℃过夜，37 ℃恒温箱中复温30 min，加兔抗大鼠IgG抗体-HRP多聚体，37 ℃ 30 min(以上每步后用 PBS洗3次，每次3 min)， DAB显色(镜下控制显色时间)，后经苏木素复染，脱水透明、封片显微镜下观察结果。PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.5　结果判断

参照姚芳芳等[7]采用标准：(1) 显微镜下观察着色广度：0分，阳性细胞数比率〈1%;1分，阳性细胞数比率2%～25%;2分，阳性细胞数比率26%～50%;3分，阳性细胞数比率51%～75%;4分，阳性细胞数比率〉75%。(2)着色强度：0分，细胞无着色;1分阳性细胞染色呈淡黄色颗粒;2分，阳性细胞染色呈棕黄色颗粒;3分，阳性细胞染色呈深褐色颗粒。(3)广度×强度=总分(0-12)：阴性(Ⅰ：0-1);阳性(Ⅱ：2-4);强阳性(Ⅲ：5-8;Ⅳ：9-12)。(注：Runx3蛋白以细胞核着色为阳性)

1.3　统计学处理

用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析。计量数据以均值±标准差(x-±s)表示。P〈0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　各组大鼠腹壁肌电活动比较

模型组大鼠的腹外斜肌收缩次数较对照组明显增加，提示存在内脏感觉过敏，而两模型组之间差异无统计学意义(P〉0.05)，与对照组比较差异有统计学意义(P〈0.05)。见表1。表1　各组大鼠在不同扩张容量下腹壁肌电活动比较各组肠黏膜组织结构完整，正常组和模型组大鼠肠黏膜HE染色均未见异常，未见黏膜的器质性损害及炎症细胞浸润，见图1。图1　大鼠肠组织H-E染色 100(A：IBS1组，B：对照组)

2.3　Runx3蛋白在各组肠黏膜组织中的表达

Runx3蛋白在IBS模型组及正常组肠黏膜组织中均表达，主要见于肠黏膜上皮细胞﹑腺体细胞及固有层炎性细胞(图2)，阳性细胞呈弥散性分布。棕黄色颗粒以细胞核着色为主，也有细胞浆着色。经行×列表资料的Fisher确切概率法进行比较，Runx3蛋白在模型组与照组之间表达的阳性率无显著性差异(P〉0.05)。图2　大鼠肠黏膜组织Runx3蛋白的表达×200　　(A：IBS1，B：对照组)

3　讨论

IBS是一种涉及多种因素、复杂的功能性肠病之一，其发病机制尚不清楚，普遍认为是包括胃肠运动异常、内脏感觉敏感性增高、肠道的轻度炎症等在内的多种因素共同作用的结果。其中肠道的轻度炎症[1,8]是近年来关注的热点。

Runx3是一种抑癌基因，位于染色体1P36.1，是Runx结构域转录因子家族成员。研究发现，Runx3对细胞毒性T细胞的功能性分化及其分化过程中CD4的沉默起重要作用，Runx3基因敲除小鼠CD8细胞不仅对刺激的增殖效应下降，丧失了对靶细胞的特异性杀伤能力，而且CD8+细胞总数减少，CD4∶CD8的比率较正常升高[2]。Fainaru O等[3]研究发现，Runx3介导TGF-β对DC的成熟抑制作用。Runx3基因敲除小鼠在4周龄时自发炎症性肠病，其特点是白细胞浸润，黏膜增生，淋巴集群的形成及免疫球蛋白的增多，在8个月时，出现上皮细胞分化增快和胃黏膜细胞玻璃样变性，对其结肠黏膜内细胞因子的分析发现，出现了混合辅助性T1/T2反应[9]。

为验证炎症因素在IBS发病中作用，以及了解肠易激综合征大鼠模型结肠Runx3的表达，我们在前期研究IBS大鼠模型[10]的基础上，采用乙酸灌肠和束缚应激的方法制造IBS大鼠模型，结果发现乙酸灌肠14 d后，大鼠肠黏膜组织学检查虽未发现水肿﹑充血及炎症细胞浸润等病理学改变，但内脏敏感性评价提示结肠敏感性增高，符合IBS的病理生理特征，反映了炎症因素在IBS发病中的作用。但Runx3在两组IBS大鼠模型中的表达和对照组无显著性差异(P〉0.05)，考虑可能与IBS1大鼠模型炎症急性期已恢复有关。已有研究证实Runx3从多个方面影响免疫细胞的发生和发育，参与调节和维持机体的免疫平衡，如对T细胞的功能性分化[2]、树突状细胞的成熟抑制[3]及调节细胞因子表达的主要转录因子的表达[4]等，因此，有关Runx3在IBS发病中的作用仍有待于进一步研究。

【参考文献】

1  Chadwick VS， Chen W， Shu D， et al. Activation of the mucosal immune system in irritable bowel syndrome[J]. Gastroenterology， 2002,122(7)：1778-1783.

2  Taniuchi I， Osatom M， Egawa T， et al. Differential reqirements for Runx proteins in CD4 repression and epigengetic silencing during T lymphocyte development [J]. Cell,2002,111(5)：621–633.

3　Fainaru O， Woolf E， Lotem J， et al. Runx3 regulates mouse TGF-beta-mediated dendritic cell function and its absence results in airway inflammation [J]. EMBO J， 2004,23(4)：969-979.

4  Brenner O， Levanon D， Negreanu V， et al. Loss of Runx3 function in leukocytes is associated with spontaneously developed colitis and gastric mucosal hyperplasia [J].Proc Natl Acad Sci USA， 2004,101(45)：16016–16021.

5　Williams CL， Villar RG， Peterson JM， et al. Stress-induced changes in intestinal transit in the rat： a model for irritable bowel syndrome [J]. Gastroenterology， 1988,94(3)611-621.

6  Ness TJ， Gebhart GF. Colorectal distention as a noxious visceral stimulus： physiologic and pharm acologic characterization of pseudaffective reforexes in the rat[J].Brain Res,1988,45：153-169.

7　姚芳芳， 郭长存， 贺莉， 等. Runx3在溃疡性结肠炎中的表达[J]. 现代生物医学进展，2008,8(6)：1119-1121.

8  Dunlop SP， Jenkins D， Spiller RC. Distinctive clinical， psychological， and histological features of postinfective irritable bowel syndrome[J]. Am J Gastroenterol,2003,98(7)：1578-1583.

9  Brenner O， Levanon D， Negreanu V， et al. Loss of Runx3 function in leukocytes is associated with spontaneously developed colitis and gastric mucosal hyperplasia[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(45)：16016-21.

10　安钰，白殿卿，符健，等.乙酸灌肠加束缚应激致大鼠肠易激综合征模型的建立及其评价[J].世界华人消化杂志，2009,17(15)：1548-1551.