水通道蛋白8对脓毒症大鼠肝细胞线粒体形态的影响

脓毒症(sepsis)是指感染引起的全身性炎症反应综合征(sIRS),是一种有着高发病率和病死率的危重症,是ICU患者病死的主要原因[1]。肝脏是脓毒症状态下最易受累的器官之一,肝功能不全是脓毒症发展为多器官衰竭(MOF)的早期表现之一[2]。肝细胞线粒体是物质和能量代谢中心,在调节细胞内信号传导和细胞凋亡等方面起着重要作用[3]。水通道蛋白8(aquapo。n-8,AQP8)是在肝细胞线粒体内膜上表达的一种水分子通道,是具有高度选择性和高效转运水分子的特异孔道,对维持大鼠肝细胞线粒体的结构和功能具有重要作用[4]。本研究通过观察脓毒症大鼠肝细胞线粒体AQPS蛋白水平和AQPg mRNA表达,旨在探讨在脓毒症状态下, AQPg的表达量对肝细胞线粒体形态的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

1.1.1 实验动物 选用成年SD大鼠zzI只,雌雄各半,体质量160~⒛0g,由安徽医科大学实验动物中心提供合格证号:SCⅩΚ(皖)2OO5-OO叫。

1,1.2 主要材料与设备 兔抗大鼠AQP8多克隆抗体(A朊am公司,美国)、小鼠抗大鼠Pr。hibitin单克隆抗体(Abcam公司,美国),辣根过氧化物酶偶联二抗(羊抗兔,⒌ntacmz公司,美国)、辣根过氧化物酶偶联二抗(兔抗小鼠,北京康为世纪公司),ECL 增强化学发光试剂盒(Pierce公司,美国),TⅡ zd总 RNA提取试剂(Invitr。gen公司,美国),MMLⅤ 逆转录酶(Invitr。gen公司,美国);platinum TAQ DNA聚合酶(Invitr。gen公司,美国)。梯度PCR扩增仪(德国产⒏ometre T-⒍adient型),GSM凝胶图像分析管理系统(珠海黑马医学仪器公司),透射电子显微镜(日产ⅢM-1230型),JDgO1病理图文分析系统 (N200683OO3115型,江苏捷达)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 采用随机数字表法将大鼠分为空白对照组(对照组)、脓毒症模型组(脓毒症组)各12只。脓毒症组采用盲肠结扎穿孔术 (CLP)制作脓毒症模型[5]:术前动物自由饮水,禁食12h,腹腔注射10%水合氯醛麻醉。腹正中线切口, 暴露盲肠并结扎根部,用16号穿刺针在结扎处和盲端的1/2位置穿刺2次,挤出少许肠内容物,然后将肠管回纳人腹腔,依次缝合腹膜和皮肤。术毕立即皮下注射5mL/100g生理盐水,同时肌肉注射青霉素2万U/只,预防切口感染;对照组注射等量生理盐水。观察两组动物的体温、呼吸频率、心率变化和对外界刺激的反应,达到脓毒症诊断标准后观察 1h,在麻醉后用断头法处死实验大鼠。

1.2.2 线粒体提取[6〕 处死大鼠后迅速取出肝脏,充分匀浆后置于预冷的分离介质中(220mmol/ L甘露醇,⒛ mm。l/L蔗糖,1mm。l/L‰s-HCl,5 mmol/L EDTA and1mmoL/L EGTA)。匀浆物经~sO0 g离心10min后,弃沉淀,留取上清液,再经1000g 离心10耐n,再将上清液经3000g离心10而n,沉淀物(肝细胞线粒体3000g组分)用加了蛋白酶抑制剂PMSF的分离介质稀释备用。以上所有操作均在4℃ 下进行。

1.2.3 线粒体AQP8蛋白检测 采用Western blot 法测定线粒体AQP8蛋白水平。用BCA法测定线粒体悬液蛋白浓度后取蛋白含量约为120鹏的线粒体悬液,加人上样缓冲液,⒛ ℃加热10min后进行浓度为13%的SDs聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后转至PⅤDF膜上,用含5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭1h,加兔抗大鼠AQP8多克隆抗体,浓度 1:5OO,4℃ 孵育过夜;再加辣根过氧化物酶标记的二抗,浓度⒈BOOO,室温孵育Ih。清洗后用ECL液曝光显影,冲洗胶片。利用样本目的蛋白的内参照条带(pr。hibitin)的吸光度,比较不同样本的AQP8 蛋白的相对表达量。用Ilnage-pro软件分析计算 AQP8蛋白相对表达量[AQP8相对表达量(%)AQPg条带灰度/pr。hibitin条带灰度]。

1.2.4 AQP8mRNA检测 采用RT⋯ PCR法检测肝细胞线粒体AQP8mRNA水平。取肝脏组织约 10O mg,用triz。l法提取总RNA,测定RNA浓度后取 2昭RNA,按反转录试剂盒说明对其进行反转录。引物由上海生工生物服务技术有限公司合成,AQPs 上游:5′ -GGTGGACACTTCAACCCTGC-3′ ,下游: 5′ -CCCAGCCAGTAGATCCAATG-3′ ,产物437bp; β-actin~L游:5′ -叩GTCACCAACTGGGACGAT- 3′ ,T游:5′ -TAATGTCACGCA叩CC-3′ ,尸=物414 bp。采用∞ uL反应体系,其中10× PCR缓冲液 (不含Mg离子)5uL,10mm。l/L dNTP混合液1 uL,∞ mm。l/L MgC121.5uL,上下游引物各1.5 uL,模板DNA2uL,taq DNA聚合酶0.2uL,灭菌蒸馏水38.8uL。扩增条件:%℃ 、5mh;94℃ 、⒛ s,Tm(AQP861℃ ,β -actin58℃ ),72℃ 45s,共笏循环;72℃ IO min;4℃ 保温。PCR产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后用GSM凝胶成像系统照相,并用Image-pro软件对电泳条带进行灰度扫描,分析AQP8mRNA相对表达量(AQP8相对表达量%AQPg条带灰度/β -actin条带灰度)。

1.2.5 肝细胞线粒体形态学观察 在0~4℃ 条件下,取约1mm× 1mm× 1mm新鲜肝脏组织,用2. 5%的戊二醛固定,再经脱水、包埋、切片、醋酸铀- 硝酸铅双重染色制成超薄切片,在电镜下观察并照相。

1.3 统计学处理 采用SPSS13,0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(沅±s)表示,均进行正态性检验,组间比较采用单因素方差分析(one~ way AN0Ⅴ A),以P(0.Os为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线粒体超微结构变化 对照组肝细胞大小形态正常,细胞核边界清楚;粗面内质网结构清晰,肝细胞内线粒体数目较多,呈圆或椭圆形,无肿胀,线粒体内部结构清晰,未见空泡化,嵴呈同心圆或纵形排列,密集清晰,核膜完整,染色质分布均匀。而脓毒症组肝细胞肿大,细胞内可见大量粗面内质网扩张、断裂,胞质疏松化,线粒体数目明显减少,线粒体显著胂胀、空泡化、破坏,基质浓缩,脊变宽,胞浆内可见脂肪滴。细胞核膜边缘不光滑,形成不规则突起,致使细胞核固缩、变小。见彩色插页图1。

2.1.2 肝细胞线粒体AQP8蛋白水平分析 以 prohbitin作为内参,AQP8/pr。hibitin表示AQP8蛋白相对表达水平,将对照组的AQPS蛋白相对表达水平设为1,计算出脓毒症组(乃=12)AQPg蛋白相对表达水平为0.⒍ ±0.Og,较对照组减少平均约 39%,差异有统计学意义(F=能,71,P(0.01)。见图2。

2.3 AQP8mRNA水平分析 以β-actin作为内参,AQPs/β ⋯actin表示AQP8mRNA相对表达量, 将对照组的AQPS mRNA相对表达水平设为1,脓毒症组AQPg mRNA相对表达量为1.S9± 0.⒛ ;AQPg mRNA表达较对照组增加平均约59%,差异有统计学意义(F=钾.gs,P<0.01)。见图3。

3 讨论近年来,随着对脓毒症的发生机制和病理生理过程研究的不断深入,其临床救治也取得了重大进步,但脓毒症所致的感染性休克和MOF仍然是当前重症医学面临的棘手问题[7]。脓毒症常伴有肝脏损伤,肝细胞线粒体的损伤在重症感染引起的MOF 发病申出现最早,并且影响机体重要脏器能量肝细胞线粒体AQP8mRNA表达谢底物的交换平衡。AQPg是在肝细胞表达最多的一种水通道蛋白,其广泛分布于肝细胞内膜、线粒体内膜和滑面内质网、接近顶质膜的囊泡[:]。AQP8 表达下调会导致线粒体肿胀、变性,从而对机体的能量代谢产生较大的影响[9]。本研究对肝细胞线粒体形态学观察发现,脓毒症状态下,肝细胞肿胀,线粒体数目明显减少,线粒体呈现空泡化、破裂,基质浓缩,脊变宽,胞浆内可见脂肪滴;可见此时线粒体结构破坏严重。对肝细胞线粒体膜AQP8蛋白的检测发现,此时AQ"蛋白表达减少。由此推测,肝细胞线粒体的肿胀、空泡化和破裂等改变,可能是由于AQPs蛋白表达减少所致。AQPg主要介导线粒体内外水的转运,我们推测,AQP8蛋白表达减少,线粒体内水分子无法转运至线粒体外[1° ],导致线粒体过度肿胀、破裂,引起线粒体结构及功能受损,造成能量代谢障碍。同时还发现,此时AQP8mRNA的表达并未减少,而是增加,表明AQPg蛋白减少并非是AQP8mRNA的表达减低所致。

肝细胞线粒体AQP8蛋白表达受AQP8基因转录及翻译等环节的调控,其在转录和翻译水平的异常改变都将会引起AQP8蛋白的表达变化,使其介导的线粒体内水转运失调。AQP8的转录水平下降,即AQP8mRNA的表达下调,翻译水平的AQP8 蛋白合成量也下降,AQP8介导的水转运发生障碍, 可能与出现线粒体肿胀有关;而AQPg mRNA表达上调时,AQPs蛋白的相对表达量本应该升高,可使线粒体膜对水的通透性增加。但本研究结果是线粒体AQPg mRNA表达上调,AQPg蛋白相对表达量反而下降,AQPS蛋白表达减少与AQPg mRNA增加不相对应,因而认为,脓毒症状态下AQ"表达下调可能是由于存在转录后抑制所致[11]。同时,AQP8 mRNA表达增加可能是由于机体对线粒体内水分子集聚引起的AQPg需求量增加所产生的代偿机制所致。有研究发现[11],在大肠杆菌脂多糖(LPS)诱导的脓毒症相关性胆汁淤积症模型中,存在肝细胞 AQP8转录后抑制的现象,而引起AQPs蛋白表达的下调。AQPg的表达除了受到转录和翻译水平的影响外,可能也受到其他因素的影响;研究[⒚ ]证实,调控肝脏AQP8囊泡运输的微管和cAMP抑制剂、 AQP8阻断剂、AQ"的功能表达缺陷等因素均可引起AQPg功能障碍,使细胞器膜对水的通透性降低, 导致肝细胞及其线粒体肿胀。

综上所述,脓毒症状态下,机体出现肝细胞线粒体的肿胀、破裂;此时AQPg蛋白表达减低,这可能是线粒体水肿的主要原囚之一;由于机体的代偿机制,AQP8mRNA的表达是增加的,AQPg蛋白表达并未能相应增加,可能是由于存在转录后抑制所致。在治疗上,如能上调AQPg蛋白表达,可能有利于保护线粒体的结构完整。

参考文献

[1] Kallinen O,Maisniemi K,B(o)hling T . Multiple organ failure as a cause of death in patients with severe burns . JOURNAL OF BURN CARE & RESEARCH , 2012年 33卷 第02期

[2] 俞娅芬,陈德昌,宋秀琴 . 早期诊断严重脓毒症脓毒性休克研究进展 . 中国急救医学 , 2007年 27卷 第02期

[3] 周荣斌,周高速 . 脓毒症的诊断思路与方法进展 . 中国急救医学 , 2008年 18卷 第01期

[4] Ferri D,Mazzone A,Liquori GE . Ontogeny,distribution,and possible functional implications of an unusual aquaporin,AQP8,in mouse liver . Hepatology , 2003年 38卷 第04期

[5] Calamita G,Ferri D,Gena P . The inner mitochondrial membrane has aquaporin-8 water channels and is highly permeable to water . Journal of Biological Chemistry , 2005年 280卷 第17期

[6] Huebert RC,Splinter PL,Garcia F . Expression and location of aquaporin water channels in rat hepatocytes.Evidence for a role in canalicular bile secretion . Journal of Biological Chemistry , 2002年 277卷 第25期

[7] 武华栋,周荣斌 . 抗IL-6R单克隆抗体对脓毒症大鼠的保护机制研究 . 中国急救医学 , 2011年 31卷 第03期

[8] Lehmann GL,Carreras FI,Soria LR . LPS induces the TNF-α-mediated downregulation of rat liver aquaporin-8:role in sepsis-associated cholestasis . American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology , 2008年 294卷 第02期

[9] Zapelini PH,Rezin GT,Cardoso MR . Antioxidant treatment reverses mitochondrial dysfunction in a sepsis animal model . Mitochondrion , 2008年 8卷 第03期

[10] Calamita G,Moreno M,Ferri D . Triiodothyronine modulates the expression of aquaporin-8 in rat liver mitochondria . Journal of Endocrinology , 2007年 192卷 第01期