乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白的设计和生物活性预测

作者                      作者单位

林贤凡   温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325000

吴金明   温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325000

陈瑾     温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325000

孙慧     温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325000

申苏建   温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325000

金思思   温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325000

Design of HBsAg-ecdCD40L fusion protein and prediction of its biological characteristics LIN Xian-fan，WU Jin-ming，CHEN Jin，SUN Hui，SHEN Su-jian，JIN Si-si. Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

Abstract: Objective: To explore the reasonability of the design of HBsAg-ecdCD40L fusion protein. Methods: Using sequence analysis software and protocols prescribed on website www.expasy.com the open reading frame of the recombinant plasmid and the flexibility，hydrophilicity，antigenicity and epitope of recombinant HBsAg-ecdCD40L were analyzed and the secondary structure of HBsAg-ecdCD40L fusion protein was analyzed，too. Results: The fusion protein had correct domains of HBsAg and ecdCD40L. The linker had low antigencity and high flexibility and might not influence the secondary structure of the fusion protein. Conclusion: The design of the fusion protein is reasonable. It Keeps the maximum biological activities of HBsAg and ecdCD40L.

Key words: hepatitis B surface antigens;CD40 ligand;molecular structure prediction

目前，乙肝治疗性疫苗的研究多是在乙肝表面抗原(HBsAg)基础上进行改造，提高HBsAg的免疫原性是关键，融合适当的免疫调节因子是有效方法之一。CD40L胞外段(ecdCD40L)能与DC表面CD40分子结合，促进DC成熟，诱导特异性免疫反应，与HBsAg融合后有望提高其免疫原性。在本实验中，我们设计了HBV S-ecdCD40L融合基因，重组基因能否有效转录、表达融合蛋白，融合蛋白能否保持原有的生物活性对进一步的研究至关重要，为此，我们利用核酸、蛋白质分析软件以及互联网上提供的方案，分析重组体的开放读框及融合蛋白的生物活性，预测融合蛋白设计的合理性。

1 材料和方法

1.1 材料 ayw亚型HBV S基因序列(GeneBank编号AF280817)，人CD40L胞外段基因序列(GeneralBank编号NM_000074)，pcDNA3.1质粒序列，连接链(Linker)氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。

1.2 引物设计 为避免融合蛋白中HBsAg、CD40L胞外段两个肽段互相干扰，改变两者的性质功能，在两个基因间设计一段Linker，将HBV S基因与CD40L胞外段基因序列相连，根据GeneBank中HBV S基因、CD40L基因序列以及Linker的编码序列进行引物设计，并引入酶切位点(下划线)。HBV S基因引物顺序为上游(SF)：5’-GCGGGTACCATGGA

GAACATCACATCAGGATTC-3’，引入了Kpn I酶切位点，下游(SR)：5’-GGAGAATTCCACCGCCCGAGCCA CCGCCACCAATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAAT-3’，引入了EcoR I 酶切位点以及Linker上半段。CD40L胞外段引物顺序为上游(CD40LF)：5’-TTAGAATTCG TGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCTTCATAGAAGGTTGGACAAG ATAGAA-3’，引入了EcoR I酶切位点以及Linker下半段，下游(CD40LR)：5’-GCGCTCGAGTCAGA GTTTGAGTAAGCCAAAGGA-3’，引入了Xho I酶切位点。

1.3 pcDNA3.1-S-ecdCD40L真核表达载体的构建和软件分析模拟

1.3.1 pcDNA3.1-S-ecdCD40L真核表达载体的构建：PCR扩增得到S基因、CD40L胞外段基因后，两者经EcoR I酶切连接，连接后以SF和CD40LR为上下游引物进行PCR扩增，获得HBV S-ecdCD40L融合基因。融合基因通过Kpn I和Xho I双酶切与pcDNA 3.1(+)进行连接，所得重组体称为pcDNA3.1-S-ecdCD40L，表达融合蛋白称为乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白(HBsAg-ecdCD40L)。

1.3.2 重组体读框分析：Gene Construction kit 2.5软件分析，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

1.3.3 融合蛋白理化性质分析：应用www.expasy.org网站提供的ProtParam方案以及DNAStar软件中的Protean程序进行分析。

1.3.4 柔性分析：应用www.expasy.org网站提供的Protscale方案以及Protean程序进行分析，将HBsAg、CD40L胞外段及融合蛋白序列分别输入，以9个氨基酸为一组进行分析，将结果进行比较。

1.3.5 抗原性分析：应用Protean程序进行分析。

1.3.6 表位分析：应用Protean程序进行分析。

1.3.7 二级结构分析：应用www.expasy.org网站提供的HNN方案进行分析。

2 结果

2.1 重组体作图及读框分析结果 将HBV S-ecdCD40L融合基因插入pcDNA3.1(+)真核表达载体多克隆位点，经读框(ORF)分析证实CMV启动子下游有完整的目的基因ORF(见图1)。

2.2 理化性质分析结果 ProtParam分析显示融合蛋白分子量：50813.7 Da，等电点：8.46，负电荷残基总数(Asp+Glu)：28，正电荷残基总数(Arg+Lys)：34，分子式:C2304H3541N593O646S29，半衰期：30 h(哺乳动物)，不稳定系数[The insta-bility index(II)]：51.23，该蛋白分类为不稳定蛋白。Protean软件分析可知，HBsAg-ecdCD40L与HBsAg、ecdCD40L比较，各自的亲水性无改变，同时Linker部位呈中性，说明两个基因连接之后的亲水性和疏水性未受影响(见图3)。

2.3 柔性分析结果 柔性区的存在可使两侧的蛋白功能区正确的折叠，从而产生正确的生物结构和空间构象。经分析证实227到243位氨基酸(linker所在部位)存在高柔性区，连接链两侧的柔性区未发生改变，说明模拟表达的HBsAg和ecdCD40L由柔性肽连接，伸展性大，可自由活动，能发挥各自的生物学效能(见图2、图3)。

2.4 抗原性分析结果 融合基因表达后新接入的Linker部位不应该产生新的抗原性，而且Linker两侧的抗原性不应发生改变，HBsAg-ecdCD40L的氨基酸序列经软件分析并与HBsAg及ecdCD40L氨基酸序列的分析结果进行比较，结果显示Linker部位抗原性低，Linker两侧序列的抗原性未发生改变(见图3)。

2.5 表位分析结果 软件分析HBsAg-ecdCD40L的表位特征并与HBsAg以及ecdCD40L的表位特征比较，结果显示HBsAg-ecdCD40L具有原来各自的表位特征，无新表位出现，Linker部位(227～243位氨基酸)表位值低，说明HBsAg和ecdCD40L连接后相互之间几乎没有影响，没有新的表位出现(见图3)。

2.6 二级结构预测结果 利用HNN方案预测HBsAg-ecdCD40L融合蛋白的结构，提示其二级结构由Alpha helix(Hh): 38.78%，Extended strand (Ee): 14.16%，Random coil (Cc)：47.06%构成，linker所在部位基本为无规则卷曲，不影响两侧HBsAg和ecdCD40L的结构(见图4)。

3 讨论

乙型病毒性肝炎是世界范围内广泛传播的传染性疾病，近几年的研究表明乙型肝炎病毒(HBV)感染的控制和清除有赖于机体的免疫系统， 其感染慢性化与机体针对HBV的特异性免疫， 尤其是细胞免疫的缺陷或低下有关。DC是体内功能最强的专职抗原递呈细胞，能摄取、加工并递呈抗原，刺激未致敏T细胞的增殖和活化从而启动机体的特异性免疫应答。研究显示，慢性乙型肝炎患者存在DC功能缺陷，诱导HBV特异性T细胞反应能力受损，无法有效清除病毒，是HBV免疫逃逸机制之一[1]，因此，改善DC功能，诱导和增强机体HBV特异性免疫的治疗方法有望取得良好的抗病毒效果。

CD40L属TNF超家族成员，是一种II型跨膜糖蛋白，是参与机体特异性细胞免疫应答和体液免疫应答的重要免疫共刺激分子，能与表达于DC表面的CD40分子相互作用，调节免疫反应。经CD40L刺激后的DC具有如下特性：①抗原递呈能力增强;②具有较强的T淋巴细胞趋化能力;③体外刺激T淋巴细胞增殖反应能力增强;④表面的共刺激分子(CD80、CD86等)明显上调，并能够产生较高水平的IL-12，IFN-γ，TNF-α等细胞因子，促使Th0向Th1分化[2]。研究显示，将HPV E7基因与CD40L胞外段基因融合构建HPV E7-CD40L重组腺病毒，将其导入骨髓来源的DC，24 h及48 h后，E7-CD40L载体转染的DC分泌IL-12，IFN-γ的水平明显高于转染E7载体、GFP-CD40L载体、磷酸盐缓冲液(PBS)的对照组，而且E7-CD40L载体免疫小鼠能通过活化CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞，抑制E7+肿瘤细胞生长[3]，说明E7-CD40L载体表达的融合蛋白对DC具有明显刺激作用且，CD40L与肿瘤抗原融合后可诱导强大的肿瘤抗原特异性T细胞免疫。基于上述研究基础，我们拟在传统乙肝疫苗广泛使用的HBsAg基础上，融合CD40L胞外段，增强HBsAg的免疫原性，诱导机体产生更强的HBsAg特异性T细胞免疫应答，为新型乙肝治疗性疫苗的研究奠定基础。

获得融合蛋白首先要有科学的设计，并对其空间结构和性质有较准确的预测，而对于新的基因及蛋白，应用生物信息学技术进行分析，是了解其性质、功能的一种有效方法，可为进一步研究奠定基础，使其得到广泛应用[4-5]。我们计划构建pcDNA3.1-S-ecdCD40L重组表达载体，表达HBsAg和ecdCD40L融合蛋白，经读框分析证实，读码框与设计一致，利用软件及互联网上提供方案比较分析证实连接后产物亲水性、柔性、抗原性、表位、二级结构基本无变化，Linker部位具有柔性高、中性、抗原性低、不产生新的表位等特点，理论上不改变两侧蛋白分子的空间结构和生物活性，符合重组体设计初衷，重组体设计合理，表达的蛋白生物活性在融合过程中未受影响。当然，目前的结论只是理论上的推测，需在以后的实验中进一步得到证实。

【参考文献】

[1] van der Molen RG, Sprengers D, Binda RS, et al.FunctionalImpairment of Myeloid and Plasmacytoid Dendritic Cellsof Patients With Chronic Hepatitis B[J]. Hepatology,2004,40(3):738-746.

[2] Van Kooten C, Banchereau J.CD40瑿D40 ligand[J].J LeukocBiol,2000,67(1):2-17.

[3] Zhang LX,Tang YC,Akbulut H, et al.An adenoviral vectorcancer vaccine that delivers a tumor-associated antigen-CD40-ligand fusion protein to dendritic cells[J].PNAS,2003,100(25):15101-15106.

[4] 欧琴,朱珊丽,张丽芳. EB病毒潜伏膜蛋白2的二级结构分析和B细胞表位预测[J]. 温州医学院学报,2007,37(2):114-118.

[5] 李志群,马英骥,成军,等.乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白1基因的克隆及生物信息学分析[J].中华实验和临床感染病杂志(电子版),2008,2(3):162-168.