幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆、表达及抗体制备

作者                                    作者单位

田树伟 江苏大学　生命科学研究院;基础医学与医学技术学院病原生物学研究室, 江苏 镇江 212013

邵世和 江苏大学　生命科学研究院;基础医学与医学技术学院病原生物学研究室, 江苏 镇江 212013

韩军   江苏大学　生命科学研究院;基础医学与医学技术学院病原生物学研究室, 江苏 镇江 212013

黄河   江苏大学　生命科学研究院;基础医学与医学技术学院病原生物学研究室, 江苏 镇江 212013

黄世腾 江苏大学　生命科学研究院;基础医学与医学技术学院病原生物学研究室, 江苏 镇江 212013

Cloning and expression cagM gene of Helicobacter pylori type Ⅳ secretion　system and antibody preparation

TIAN Shuwei, SHAO Shihe, HAN Jun, HUANG He, HUANG Shiteng

(Institute for Life Sciences; Department of Microbiology, School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China)

[Abstract] Objective: To construct prokaryotic expression vector for expressing cagM(HP0537) of Helicobacter pylori(H.pylori) NCTC 11637 of Ⅳ type secretion system, to analyze its antigenicity and to produce antibodies. Methods： PCR technology was used to amplify cagM from the H.pylori genome. Then TA cloning was used for sequence analysis. We constructed expression vector pET28a(+)cagM, and transformed it to E.coli BL21. IPTG was used to induce expression. After SDSPAGE for identification of expressed protein and Ni2+NTA column for purification, used software analysis of its antigenicity, and prepared antibody by immunization of rabbits. At last, ELISA was used to detect polyclonal antibody titers. Results: cagM gene sequencing results showed that the fulllength was 1 131 bp(GenBank accession number: GU269568), encoding 376 amino acids. Compared with strains J99, 26695 and G27, its amino acid homology was 98%～99%. After the induced expression and SDSPAGE analysis, in the 43 700 position found a new band, and Ni2+NTA column purified was a single band. The software analysis showed that the antigenicity was stronger. The prepared rabbit polyclonal antibody titer was 1∶1.6 × 105. Conclusion: For the first time successfully cloned and expressed the H.pylori NCTC 11637 cagM genes, and prepared its antibody, which provide a foundation for further study its biological function, as well as the detection and treatment of Helicobacter pylorirelated diseases research in the future.

[Key words] Helicobacter pylori; Ⅳ type secretion system; cagM gene; antibody

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是一种定植于人类胃黏膜的螺旋状、革兰阴性微需氧菌，现已证实H.pylori感染是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病因[1,2]，Ⅰ型H.pylori基因组中有一个约40 kb的基因片段，即cag致病岛(cagPAI)，其编码一些毒素蛋白和一个分泌装置，即Ⅳ型分泌系统(type IV secretion system, TFSS)，TFSS形成一个跨膜通道，通过转运相关毒素如毒力蛋白CagA参与细胞信号调节，从而导致一系列病变，如胃炎、胃溃疡和胃癌等[3,4]。有研究发现cagM是Ⅳ型分泌系统的重要基因，对转运CagA和刺激上皮细胞产生炎症因子IL8非常重要[5,6]。但是，关于CagM在Ⅳ型分泌系统中的作用及在幽门螺杆菌致病过程中的作用尚未见报道。本文针对这一现状，首次克隆表达了H.pylori NCTC 11637 cagM基因全序列，并用生物信息学方法分析了其抗原性，制备了其抗体，为进一步研究其功能奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒

H.pylori NCTC 11637由中国疾病控制中心传染病预防研究所张建中教授馈赠，大肠埃希菌 DH5α，BL21和pET28a(+) 载体为江苏大学基础医学与医学技术学院中心实验室保存，pGEMT载体购自 Promega公司。

1.1.2 试剂和仪器

哥伦比亚培养基、厌氧袋(Oxoid公司);ExTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶BamH Ⅰ，Xho Ⅰ及T4 DNA连接酶，1 kb DNA标准，DL2000 DNA标准参照物、蛋白质分子量标准及IPTG(TaKaRa公司);绵羊血(杭州天和生物公司);胶回收试剂盒(上海捷瑞生物公司);Ni2+NTA(Qiagen公司);HRP 标记的羊抗鼠IgG抗体(武汉博士德公司);引物(上海生工生物公司);核酸紫外检测仪(Eppendorf Biophotometer);PCR 仪(Eppendorf 公司);电泳仪(BioRad公司);超低温冰箱ULT7903V(Thermo公司);超声破碎仪XL2020(Misonix incorporated);酶联检测仪(Metertech);凝胶成像及分析系统Chemidoc XRS(BioRad);蛋白垂直电泳仪(BioRad)，其他试剂均为普通分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 H.pylori的培养与基因组提取

将H.pylori NCTC 11637 标准菌株接种于含10%羊血的哥伦比亚平板上，37℃，微需氧培养72 h，从培养基上刮取生长状态良好的菌落，用PBS洗涤3次收集细菌。H.pylori基因组提取用酚氯仿提取法，参照《分子克隆》。

1.2.2 cagM基因PCR扩增

根据基因库中已报道的H.pylori22695的全基因组序列，用Primer5.0设计cagM引物，上游5′TAGGGATCCGAGCAGTTTGGTTCATTT3′;下游5′CGCCTCGAGCTATTCAAAGGGATTATTC3′，并在其5′端分别加入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点和保护碱基，PCR产物全长1 149 bp，PCR参数：94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Genius凝胶电泳图像分析系统分析，拍照，并用胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.2.3 目的基因TA克隆和测序

胶回收的PCR产物与pGEMT载体连接后，转化E.coli DH5α。转化后的细菌涂布于含50 μg/ml氨苄西林的LB平板筛选，挑菌于含氨苄西林的液体LB培养基中扩增，收集菌液，碱裂解法提取质粒，BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，将鉴定正确的pGEMTcagM，送上海生工生物公司测序，将测序结果提交基因库，并获取登录号。

1.2.4 生物信息学软件分析CagM化学特征及抗原性

用Antheprot 5.0软件分析CagM蛋白的氨基酸组成、相对分子质量、等电点、疏水性和抗原性等。

1.2.5 重组表达质粒的构建和鉴定

将构建好的pGEMTcagM载体和表达载体pET28a(+)都用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物电泳后将目的片段胶回收。将切胶回收纯化的目的基因和表达载体按3∶1(摩尔数)用T4连接酶进行连接，反应体积为10 μl，于16℃连接过夜。将构建的pET28a(+)cagM载体转化大肠埃希菌BL21，涂于含卡那霉素(100 mg/L)的LB固体培养基的平板中，37℃生长12～16 h。挑取单个菌落于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、250 r /min摇过夜菌，碱裂解法提取质粒，BamHⅠ进行酶切鉴定。将鉴定连接成功的重组质粒pET28a(+)cagM载体送上海生工生物公司进行测序，以确定连接方向正确。

1.2.6 融合蛋白的表达纯化

挑阳性单克隆子接种于3 ml的LB培养基中(含 100 mg/L卡那霉素)，37℃振荡培养过夜。取上述培养物按1∶50体积接种于新鲜 LB培养基，37℃振荡培养至D(600 nm)为0.5～0.6时，加 IPTG至终浓度为 1 mmol/L，37℃继续培养。收集诱导4～5 h的菌液，5 000 r/min离心液和 PBS重悬菌体，100℃ 煮沸5～10 min，离心取上清进行10%的SDSPAGE电泳分析。蛋白Ni2+NTA 柱纯化，按试剂盒的说明书操作，纯化后SDSPAGE电泳检测。

1.2.7 多克隆抗体制备

弗氏完全佐剂制备：取羊毛脂 3 g, 液体石蜡 3 ml, 卡介苗5 mg;先研磨羊毛脂和液体石蜡至乳白色均匀糊状，逐滴加入卡介苗与目的蛋白混合物，继续研磨成油包水制剂。

将弗氏完全佐剂与纯化后的CagM重组蛋白(约500 μg/ml)按1∶1的体积比例充分研磨，制备成油包水乳化剂，吸取1 ml制备好的抗原，采用每只多点免疫3次，每隔5天1次，免疫3次后用蛋白原液耳缘静脉免疫，每次约注射1 ml(1 000 μg/ml)，每隔2天1次，连续5次，末次免疫后7天心脏采血，室温放置2 h后，10 000×g离心10 min, 吸取抗血清分装贮存于-70℃。

1.2.8 ELISA测定多克隆抗体效价

取适量ELISA板条，加入包被液适量稀释的CagM重组蛋白(5 μg/ml), 100 μl/孔，4℃冰箱过夜;加入洗涤液，300 μl/孔，静置2 min, 吸出洗液弃掉，反复洗3次;加入封闭液(0.2%牛血清白蛋白)，150 μl/孔，4℃冰箱过夜后，洗3次;加入待测血清标本(倍比稀释)，同时加入阴性血清及不加血清以作为阴性对照和空白对照，100 μl/孔，37℃ 1 h，如上洗板孔3次;加入用封闭液以1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，100 μl/孔，37℃ 1 h，如上洗板孔3次;加入底物工作液(OPD)，现用现配，100 μl/孔，置37℃暗处反应5 min;每孔加入50 μl终止液(2 mol/L硫酸)混匀;酶标检测仪在450 nm处测定每孔的光密度值，扣除空白孔值后，P/N值≥2.1，判为阳性(P：测定孔光密度值;N：阴性对照孔光密度值)，其抗体效价为阳性结果(P/N值≥2.1)时的最大稀释度。

2 结果

2.1 目的基因PCR扩增结果和TA克隆鉴定

PCR结果显示在 1 149 bp左右有一条带，与预计大小一致，无非特异性条带，见图1a。将PCR产物与pGEMT载体连接产物转化至DH5α，随机挑取阳性菌落，抽提质粒，双酶切产物电泳后，阳性克隆出现的两条带分别位于约3 003 bp和1 149 bp处，见图1b。

2.2 cagM基因片段的序列测定及其编码蛋白的理化特性预测

将鉴定后的重组质粒送往上海生工进行序列测定，DNA测序结果表明，构建的重组质粒上的cagM长度为 1 149 bp，与设计序列大小完全一致，将测序结果提交基因库后，获取登录号为GU269568。基因编码376个氨基酸，其中65个碱性氨基酸，52个酸性氨基酸，126个疏水性氨基酸，111个非极性氨基酸，相对分子质量约为43 700，等电点为9.3。用Blast搜索发现cagM基因与基因库中已知菌株J99，26695和G27的同源性在96%以上，而CagM蛋白的同源性在98%以上。如图2，从疏水性曲线和亲水性曲线可以看出CagM蛋白有多个疏水区域和多个亲水性区域;从易溶性曲线明显可以看出CagM有7个易溶区，N端有4个大的区域，分别位于28-35，81-94，138-148和181-193处，C端有3个小区域位于315-355之间;图中抗原性曲线有多个峰，位置与易溶曲线吻合。

2.3 重组表达质粒的酶切鉴定

重组质粒 pET28a(+)cagM经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定结果见图3。

2.4 目的蛋白在E.coli中的表达与纯化

含重组质粒的转化菌经IPTG诱导后进行SDSPAGE分析，结果显示约43 700处出现一条蛋白带，见图4，与理论推算目的蛋白的相对分子质量43761.99基本一致。通过优化诱导温度、诱导时间和IPTG浓度，确定最佳表达条件，大量诱导表达，用Ni2+NTA 柱纯化后，SDSPAGE分析，发现纯化后蛋白条带清晰，无杂带，说明目的蛋白纯度很高，见图5。

2.5 CagM的多克隆抗体制备结果

CagM重组蛋白免疫家兔获得抗CagM多克隆抗体，以免疫前兔血清作为阴性对照，对抗体进行倍比稀释后做ELISA，每个稀释度做3个复孔，测定450 nm时的光密度值，取平均值，抗体效价是可以检测为阳性结果(P/N≥2.1)时的最大血清稀释倍数。结果见表1，根据测定结果，抗体效价为1∶1.6×105。表1 CagM抗体效价测定结果(略)

3 讨论

幽门螺杆菌cag致病岛基因呈高密度分布并编码CagA和VacA等毒素和一个分泌转运系统(TFSS)。Tanaka等[7]认为 H.pylori的TFSS装置是伸出细菌外膜表面的丝状大分子结构，且目前认为，TFSS可以通过转运细胞相关毒素CagA 而参与H.pylori诱导上皮细胞内的酪氨酸磷酸化、细胞骨架重排、基垫结构形成、活化核转录因子NFκB、诱导促炎细胞因子白细胞介素8的表达等，在 H.pylori致病中起着关键作用[8-12]，该致病岛的分割及缺失或突变可以引起致病菌株的毒力下降。因此，研究TFSS的结构和功能以及其组成蛋白的结构和功能对H.pylori相关疾病的诊断和治疗具有很大意义。CagM作为TFSS的重要组成之一，在其组装和转运CagA等过程中有重要作用，但是CagM的结构和功能尚未有研究报道。

本研究针对这一现状，用PCR技术从H.pylori NCTC11637菌株中克隆出cagM全长基因片段，并对其DNA序列进行测定，将测序结果提交基因库，丰富了H.pylori的基因信息。序列比对是发现新基因和研究基因功能的重要手段，所以本研究用同源序列比对分析发现cagM基因与基因库中已知菌株基因的同源性均在96%以上，且CagM蛋白的同源性在98%以上。这说明cagM基因是一个很保守的基因，预示了其在H.pylori的生活史中有重要功能，证明其在H.pylori进化过程中发挥了重要作用。现在，生物信息学作为一门新兴的综合学科，给生物科学的发展开辟了新的领域。诺贝尔奖获得者W.Gilbert在1991年曾经指出，一个科学家现在可以从理论推测出发，然后再回到实验中去，追踪或验证这些理论假设，这就是生物信息学的价值所在。本研究用软件分析了CagM蛋白的氨基酸组成和其他理化性质，为进一步的研究其结构和功能提供了理论依据。疏水性和亲水性分析是蛋白质分析的重要部分，CagM整个蛋白有7个易溶区域，且与亲水性区域一一对应，这提示CagM在形成高级结构时这些区域显露在外面，形成可溶性区域，其他疏水性区域则被包裹在蛋白质内部形成疏水内核。蛋白质的结构决定其功能，通过分析其抗原性看出，CagM有多个抗原决定簇，抗原性很强，其分布与易溶区域吻合，可见其在包装折叠过程中亲水区域显露在外部形成抗原决定簇，在抗原性曲线上N端有4个较强的峰，C端有几个弱的峰，这提示CagM的抗原决定簇主要集中在N端。

近年来，免疫学实验技术得到空前的发展，几乎可以应用到生物医学的各个领域，例如：免疫亲和层析、免疫印迹、免疫标记、免疫PCR、免疫细胞分离，免疫检测、免疫鉴定和免疫分离等。CagM是一个保守性和抗原性都很强的蛋白，制备其高纯度蛋白和抗体可以用于上述各领域，这对进一步研究其结构和功能以及研究H.pylori致病机制、H.pylori检测、H.pylori相关疾病的治疗、H.pylori Ⅳ型分泌系统的组装机转运机制和H.pylori疫苗筛选等有很重要的意义，所以本研究用重组工程菌在IPTG诱导下表达出目的蛋白，并用Ni2+NTA 柱将其纯化，获得了CagM工程蛋白，并通过免疫家兔获得CagM高效价多克隆抗体。

【参考文献】

[1]Backert S, Schwarz T, Miehlke S, et al. Functional analysis of the cag pathogenicity island in Helicobacter pylori isolates from patients with gastritis, peptic ulcer, and gastric cancer[J]. Infect Immun, 2004, 72(2): 1043-1056.

[2]Sanders MK, Peura DA. Helicobacter pylori associated diseases[J]. Curr Gastroenterol Rep, 2002, 4(6): 448-454.

[3]Cui LL，Shao SH. The type Ⅳ secretion system encoded by the cag PAI of Helicobacter pylori[J]. Wei Sheng Wu Xue Bao, 2007, 47(4): 743-745.

[4]Hatakeyama M. Oncogenic mechanism of Helicobacter pylori[J]. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, 2008, 31(3): 132-140.

[5]PintoSantini DM，Salama NR. Cag3 is a novel essential component of the Helicobacter pylori Cag type Ⅳ secretion system outer membrane subcomplex[J]. J Bacteriol, 2009, 191(23): 7343-7352.

[6]Mattar R, Marques SB, Monteiro Mdo S，et al. Helicobacter pylori cag pathogenicity island genes: clinical relevance for peptic ulcer disease development in Brazil[J]. J Med Microbiol, 2007, 56(Pt 1): 9-14.

[7]Tanaka J, Suzuki T, Mimuro H, et al. Structural definition on the surface of Helicobacter pylori type Ⅳ secretion apparatus[J]. Cell Microbiol, 2003, 5(6): 395-404.

[8]Bourzac KM, Guillemin K. Helicobacter pylorihost cell interactions mediated by type Ⅳ secretion[J]. Cell Microbiol, 2005, 7(7): 911-919.

[9]Naumann M, Wessler S, Bartsch C, et al. Activation of activator protein 1 and stress response kinases in epithelial cells colonized by Helicobacter pylori encoding the cag pathogenicity island[J]. J Biol Chem, 1999, 274(44): 31655-31662.

[10]Wataru S, Yoshihiro H, Haruhiko Y, et al. NFκB and ERKsignaling pathways contribute to the gene expression induced by cag PAIpositiveHelicobacter pylori infection[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(39): 6134-6143.

[11]Covacci A, Rappuoli R. Tyrosinephosphorylated bacterial proteins: Trojan horses for the host cell[J]. J Exp Med, 2000, 191(4): 587-592.

[12]Oliveira MJ, Costa AC, Costa AM, et al. Helicobacter pylori induces gastric epithelial cell invasion in a cMet and type Ⅳ secretion systemdependent manner[J]. J Biol Chem, 2006, 281(46): 34888-34896.