VEGFA及其受体VEGFR1与子宫内膜癌生物学行为关系的探讨

作者                    作者单位

周怀君 南京大学医学院附属鼓楼医院 妇产科,江苏 南京 210008

寻庆英 南京大学医学院附属鼓楼医院 妇产科,江苏 南京 210008

夏宝妹 南京大学医学院附属鼓楼医院 妇产科,江苏 南京 210008

子宫内膜癌的侵袭与转移明显影响着病人的预后，而肿瘤血管的生成是肿瘤侵袭与转移所必须;研究表明，VEGFA可诱导血管生成[1]。本研究就50例子宫内膜癌患者的癌组织及癌旁正常内膜的VEGFA及其受体VEGFR1的表达进行检测，以探讨它与子宫内膜癌生物学行为的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

50例子宫内膜癌及癌旁正常内膜组织标本取自2004年3月至2006年12月间在南京大学医学院附属鼓楼医院的住院患者。年龄42～77岁，平均55岁。手术病理分期:Ⅰa 2例，Ⅰb 16例，Ⅰc 15例，Ⅱa 6例，Ⅱb 2例，Ⅲa 2例，Ⅲc 7例。子宫内膜腺癌组织学分级：G1 11例，G2 20例，G3 19例。

1.2 标本采集

子宫离体后立即纵行剖开，取癌组织约2 cm×1 cm大小,在癌组织基底部2 cm外侧取正常内膜约2 cm×1 cm大小。标本立即放入液氮罐中，-70 ℃冰箱中保存。

1.3 采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测mRNA的表达1.3.1 总RNA的提取与鉴定 每例标本取100 mg组织置于玻璃匀浆器中，采用Trizol一步法提取总RNA，样品经分光光度计检测吸光度A值，根据A值计算总RNA浓度，并行热稳定图像分析系统扫描各电泳带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值，即为癌组织和癌旁正常内膜组织的mRNA表达水平。

1.3.2 引物及试剂 设计的引物由上海生物工程公司合成。VEGFA扩增的上游引物为5′GCAGAAGGA

GGAGGGCAGAATC3′，下游引物为5′ACACTCCAGG

CCCTCGTCATT3′，扩增片段长度为197 bp。VEGFR1扩增的上游引物为5′CAAGTGGC CAGAGGCATGG

AGTT3′，下游引物为5′GATG TAGTCTTTACCATCC

TGTTG3′，扩增片段长度为498 bp。以βactin为内参照，上游引物为5′TT CCAGCCTTCCTTCCTGG3′，下游引物为5′TTGCGCT CAGGAGGAGCAAT3′，扩增片段长度为224 bp。

Trizol试剂、RNA酶抑制剂、MMIV逆转录酶及Taq DNA聚合酶均购自上海生物工程公司。

1.3.3 RTPCR 逆转录反应体系为30 μl，RNA模板量为10 μg，采用随机引物法将RNA逆转录为cDNA，在PTC200PCR扩增仪上扩增。总反应体积为50 μl，每管加10 mmol·L-1 VEGFA或VEGFR1上下游引物各1 μl，10 mmol·L-1βactin上下游引物各1 μl，10×PCR缓冲液5 μl，15 mol·L-1MgCl2 4 μl，TaqDNA酶0.4 μl，加水至50 μl。VEGFA反应条件为：94 ℃变性1 min;56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环;复性5 min。VEGFR1反应条件为：94 ℃变性1 min;62 ℃退火2 min，72 ℃延伸3 min，35个循环;复性5 min。

1.3.4 PCR产物测定 取10 μl PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳(120 V)30 min，在紫外灯下观察扩增的特异条带，凝胶图像分析系统扫描各电泳带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值。

1.4 Western blot检测蛋白质表达

称取的组织标本0.5 g与500 μl的 RIPA组织裂解液加入玻璃匀浆器中，在冰中进行组织匀浆，4 ℃、12 000 g离心10 min，取其上清液，各标本取50 μl测蛋白浓度(Brandford法)，调整各标本蛋白质量浓度为2 mg·L-1。取调整浓度后的组织细胞裂解液10 μl加入等体积2×电泳加样缓冲液，均匀后置95 ℃水中加热10 min。采用的分离胶浓度为12%，积层胶浓度为5%，在装置(Hoefer Pharmacia Biotech Inc，USA，型号为miniVE Complete，美国)上电泳，积层胶电压为80 V，分离胶电压为120 V;电泳结束后转膜，转膜装置(BioRad公司，型号miniprotein Ⅱ cell，美国)设电压90 V、电流200 mA。转膜后的硝酸纤维素膜在封闭液中温和震荡1 h，再把膜放入1∶250的稀释一抗中，4 ℃过液，用TBST液洗膜3次，把膜置于1∶2 000稀释的二抗中温和震荡1 h，在TBST中洗膜3次，在暗室中膜上加入ECL液4 ml，曝光、显影、定影。图像分析系统扫描各X片条带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值,即为癌组织和正常内膜组织的蛋白质表达水平。

2 结 果

2.1 子宫内膜癌及癌旁正常子宫内膜VEGFA和VEGFR1的表达 结果见表1和图1。

2.2 子宫内膜癌VEGFA和VEGFR1的表达与组织病理学关系 结果见表2、3。癌旁及深肌层组VEGFA在mRNA及蛋白质的表达明显高于浅肌层侵袭组(P<0.05);G3明显高于G1、G2(P<0.05)。淋巴结转移组在mRNA及蛋白质的表达与淋巴结未转移组无显著差异(P>0.05)。宫旁及深肌层组VEGFR1在mRNA及蛋白质的表达明显高于浅肌层侵袭组(P<0.05;G3与G1、G2在mRNA及蛋白质的表达无差异(P>0.05)。淋巴结转移组在mRNA及蛋白质的表达与淋巴结未转移组无显著差异(P>0.05)。表1子宫内膜癌及癌旁正常子宫内膜

3 讨 论

3.1 VEGFA及其受体VEGFR1的分泌及作用机制

VEGFA是由肿瘤细胞及炎症浸润细胞所分泌[1]。它通过其受体VEGFR1及VEGFR2引起血管生成[2]。VEGFR1在血管内皮细胞上表达，也可在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、外周细胞和胎盘的滋养细胞中表达[3]。Laxmanan等[4]研究发现VEGFA可通过树突状细胞上的VEGFR1改变树突状细胞的功能，从而使机体对肿瘤细胞的免疫抵抗力下降，肿瘤细胞易于转移和扩散。Yokoyama等[5]通过对86例子宫内膜癌组织进行免疫组化研究发现，VEGFA及其受体在子宫内膜癌细胞浆表达。VEGFR1和VEGFR2在癌组织中也可在血管内皮细胞上表达。通过自分泌和旁分泌调节肿瘤血管的生成，促进肿瘤细胞的增殖。本研究结果显示，与癌旁正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织VEGFA和VEGFR1的表达明显增高;表明子宫内膜癌组织分泌VEGFA和VEGFR1。表2 子宫内膜癌VEGFA的表达与手术病理分期的关系表3 子宫内膜癌VEGF1的表达与手术病理分期的关系

3.2 VEGFA及其受体VEGFR1在子宫内膜癌侵袭与转移的作用 本研究结果显示，癌组织VEGFA和VEGFR1的表达明显高于正常内膜组织，深肌层和宫颈宫旁侵袭时VEGFA和VEGFR1的表达明显高于浅肌层侵袭，但淋巴结转移患者VEGFA和VEGFR1的表达与未转移者无差异。Masatsugu认为，肿瘤的血管及淋巴管的生成是肿瘤的发展与转移所必需的。当肿瘤无血管形成时可持续几个月甚至几年不发生侵袭及转移;当从无生成血管的肿瘤细胞亚型变成生成血管的肿瘤细胞表型时，可促进肿瘤快速生长及转移。含有大量生成血管细胞的原发肿瘤可引起转移，使肿瘤在淋巴结及远处器官生长。即肿瘤细胞产生VEGFs越多，越易引起肿瘤侵袭与转移。Hirai等[6]研究认为,VEGFA的表达与子宫内膜癌的血管侵袭有关,与淋巴管侵袭无关,与淋巴结转移有关。Soufla等[7]研究发现，VEGFA在宫颈癌组织的表达明显高于CIN及正常宫颈组织，并与血管密度有关。

本研究表明，子宫内膜低分化及未分化癌细胞VEGFA的表达明显高于高分化及中分化。这也可以解释分化差的癌组织易于深肌层侵袭及淋巴结转移。

总之，VEGFA的表达与内膜癌的侵袭明显相关，与淋巴结转移无关，可作为内膜癌病人预后的指标。

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