遗传性角膜病小鼠生物学特性观察

作者             作者单位

朱顺星 南通大学实验动物中心， 南通 226001

孙丽   南通大学实验动物中心， 南通 226001

刘春   南通大学实验动物中心， 南通 226001

To accumulate basic knowledge of biological characteristics of congenital corneal opacity mice

1，2ZHU Shunxing， 1SUN Li， 1，2LIU Chun， et al (1Laboratory Animal Center， Nantong University， Nantong 226001;2Research Insititute of Comparative Medicine， Nantong University， Nantong 226001)

[Abstract] Objective: To accumulate basic knowledge of biological characteristics of congenital corneal opacity B6 mice induced by N-ethy-N-nitrosourea(ENU). Methods: The reproductive indexes and growth parameters were observed and compared between congenital corneal opacity mice and the normal phenotype ones， and so were organ weights， organ coefficients， blood routine parameters， uric routine parameters， and behavioural factors between different phenotypes of B6-Co mice. Results: B6-Co mice showed higher sterile rate， and significant lower average litter size and survival rate at weaning than the normal B6 mice， but the time interval between deliveries was shorter in the mutant population. During the first two weeks after birth， the growth performances were not significant between the mutant mice and the normal ones， but after that， the mutant mice grew much slower. The differences were significant in the indexes of eyes， lungs， thymuses， and adrenal glands between the genders. At the same time， the differences were significant in the organ indexes， such as lungs， adrenal glands， uterine and testicles between the normal phenotype mutant mice and the abnormal ones. And these two kinds of mice showed different amount of hemoglobin and red blood cell. The performance grades in balance beam of B6-Co normal mice， B6-Co single eyed ones and B6-Co double-eyed ones were decreased sequentially， and were negatively correlated with the degrees of cornea lesion. The performance grades in tightrope task and nesting experiment among the three groups were not significant. Conclusion: Gene mutation was the reason why the congenial corneal opacity mice had lower reproduction index and growth rate. The differences between the organ indexes and blood routine parameters were significant among these three groups. The motor coordination ability was somewhat influenced in abnormal phenotype B6-Co mice.

[Key words] Congenital corneal opacity; Mouse; Organ weight/Organ index; Behavioural test; Biological characteristics

人类先天性角膜浑浊是一种常见眼病，其引起的角膜浑浊是我国致盲的主要原因(仅次于白内障)。现在已经明确的是，人类许多先天性角膜浑浊的发生与遗传因素有关或存在家族史，在部分家系表现为常染色体显性遗传。但其发病机理及有关遗传基础尚不明确[1-2]。由于在人类先天性眼病的研究中存在着许多限制性因素，比如家系收集、遗传、抑制性及表型模拟等，对于人类的先天性角膜疾病的发生机制及致病基因的克隆等研究难度较大，假如借助于动物模型，将会对角膜病的研究带来很大的帮助[1]。

遗传性角膜病小鼠(B6-Co)是通过ENU(乙酰基亚硝基脲)对C57BL/6J小鼠诱变所获得的一种突变系小鼠。在前期的研究中，邵义祥等[1]通过该诱变方法获得了该眼突变的突变系，发现该小鼠可能为单基因显型遗传病，并将其突变基因初步定位于13号染色体距着丝粒45.24 cM处。其杂合子小鼠在角膜的外观形态上与正常的B6小鼠比较存在着明显的差异，主要表现为单眼或双眼出现不同程度的角膜病变，角膜呈均质云雾状、不透明，虹膜和瞳孔不可见。病理切片证实为角膜基质变性，虹膜、晶状体、玻璃体及视网膜无明显异常[2]。

B6-Co小鼠眼部异常与人类角膜营养不良中的先天性角膜基质变性极其相似，以此为基础，可以进一步研究突变基因在该病发生、发展中的机制，为人类先天性角膜病的研究提供帮助。B6-Co小鼠还可以作为一个极好的模型用于相关药物的筛选、基因药物的开发以及对突变基因的克隆等相关方面的研究。

本研究旨在观察遗传性角膜病小鼠这一新突变系的生物学特性，了解其特征和性状，为此动物模型的进一步研究应用打下良好的基础，为该小鼠将来在生物医学领域中的实际应用提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 C57BL/6J小鼠(B6)和遗传性角膜病小鼠(B6-Co)由南通大学实验动物中心提供，均符合清洁级标准。实验动物生产许可证：SCXK(苏)2002-0002，使用许可证：SYXK(苏)2002-0022。

1.2 饲养条件 实验小鼠均饲养在屏障环境中，饲养环境指标符合国家标准要求。室内温度控制在20～25 ℃，氨浓度≤14 mg/m3，湿度控制在40%～70%之间，噪音≤60 dB。饲喂经60Co γ辐照灭菌的全价颗粒饲料(由苏州市双狮实验动物饲料科技有限公司生产)，自由采食，饮用纯净水，每周换两次垫料，根据饮水情况及时更换水瓶。

1.3 繁殖性能和生长发育的观察

1.3.1 繁殖性能的观察 正常B6小鼠繁殖性能及生长发育情况的数据由南通大学实验动物中心饲养室提供。遗传性角膜病小鼠的繁殖采用正常B6与角膜病小鼠交配的方式。共配50对，其中11对为B6雄性小鼠与B6-Co雌性小鼠配对，39对为B6-Co雄性小鼠与B6雌性小鼠配对。观察并记录不育率、胎间隔、窝产仔数、离乳率、仔鼠角膜病变表型数。

离乳率=离乳数/出生数×100%

平均窝产仔数=仔鼠总数/窝数

1.3.2 生长发育的观察 仔鼠从出生后1周开始对其称重，每周1次至6周龄。

1.4 脏器重量和脏器指数的测定 在繁殖后代中随机抽取6周龄的B6-Co表型正常小鼠、B6-Co单眼(单眼病变)小鼠、B6-Co双眼(双眼病变)小鼠各24只，雌雄各半，禁食12小时。用JY4001天平(上海天平仪器厂)对小鼠进行称重，颈椎脱臼处死后，分离所需脏器，剔除脂肪、筋膜、结缔组织，滤纸吸去表面血液、体液。然后用FA1004天平(上海精密科学仪器有限公司)分别对眼球、心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、睾丸、子宫、卵巢进行称重，肠测量其长度。最后计算脏器指数。

脏器指数=脏器重量(mg)/ 体重(g)

1.5 血常规和尿常规 随机抽取6周龄的B6-Co表型正常小鼠、B6-Co单眼小鼠、B6-Co双眼小鼠各25只，雌雄不拘。禁食12 h后摘眼球取血，收集到经10 μl K2EDTA抗凝剂预处理的试管内，每只采集0.5 ml，轻轻摇匀，防止血液凝固。2 h内用迈瑞BC-2800全自动血液细胞分析仪对血样进行WBC(白细胞)、Hb(血红蛋白)、RBC(红细胞)、HCT(红细胞压积)、MCV(平均红细胞体积)、MCH(平均红细胞血红蛋白含量)、PLT(血小板数目)、PCT(血小板压积)等指标的测定。

按压法收集小鼠的尿液，用Combi Screen 11SYS试纸(科宝11SYS抗VC尿试纸条，批号025010705052)和Combi 100尿液分析仪对尿样进行胆红素、酮体、维生素C、尿蛋白、潜血、pH、白细胞、比重等指标的测定。

1.6 行为学测试

1.6.1 行为学实验程序[3-4] 随机抽取6周龄的B6-Co表型正常小鼠、B6-Co单眼小鼠、B6-Co双眼小鼠各10只，雌雄不拘。实验小鼠满6 w后进行为期9 d的行为学实验： 运动协调能力检测(5 d)和生活习性检测(4 d)。运动协调能力检测在8∶00～16∶00期间进行。生活习性检测从第1天17∶00～第2天8∶00。

运动协调能力检测项目为抓绳和平衡木，生活习性检测项目为筑巢。各组小鼠行为测试使用统一设备，统一方法。

1.6.2 抓绳 将长160 cm的绳子绷紧于塑料盆上(其内放入10 cm深的自来水)。实验开始前，提尾将小鼠放入水中1 s，在随后的3次实验中，从尾部将小鼠提起至高于绳子，在慢慢降低直到其前爪抓住绳子的中央，小鼠的身体渐渐低于绳子后放开它，此时动物必须靠抓住绳子来支持其体重，否则它将会掉入水中。沿着绳子每隔5 cm做一标记，以测定小鼠在悬挂时水平移动的数量(动物的前爪触到1个标记记为1个跨越)。当动物掉入水中时，立即将其擦干并移入笼中休息30 s再进行下次实验。记录平均3次实验的悬挂时间和跨越数目，以平均悬挂时间+10×平均跨越数计算转换分。

1.6.3 平衡木 实验方法：将长160 cm，直径为0.6 cm的铁杆固定在塑料盆上(其内放入10 cm深的自来水)。小鼠放于杆中央60 s内观察评分，每鼠测3次取平均值。

评分标准如下∶0分—动物从杆上落下;1分—未落下也未移动;2分—未落下且移动但未到达盆边;3分—未落下且40～59 s内到达盆边;4分—未落下且20～39 s内到达盆边;5分—未落下且20 s内到达盆边。

1.6.4 筑巢 每鼠放入单独的饲养笼内，铺好2 cm垫料，笼内左上角放入6块正方形纸片(4 cm×4 cm)，放置时间为第1天晚17∶00，第2天8∶00评分。

评分标准如下: 0分—没窝形状;1分—有窝形状，窝内没有材料;2分—有窝，窝内有材料，但没有形成圆形;3分—有窝，窝内材料集中成圆形，形成杯状窝;4分—有窝，材料形成球形窝并覆盖小鼠。

1.7 统计学处理 用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。所有计量资料采用均数±标准差表示，P<0.05示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 繁殖性能

2.1.1 B6-Co小鼠的不育率高于正常B6小鼠，其胎间隔、平均窝产仔数、离乳育成率差异有统计学意义(P<0.05)。

2.1.2 B6-Co组按照不同配种方式所生的仔鼠不同表型统计结果见表2。

2.2 生长发育 B6-Co小鼠在1 w~2 w时体重与正常B6小鼠基本一致。从2 w到6 w，B6~Co小鼠的体重低于正常B6小鼠。

2.3 脏器重量和脏器指数

2.3.1 雌、雄B6-Co小鼠脏器重量和脏器指数之间的比较 由表3可看出，在6 w时，B6-Co雄性小鼠眼球和胸腺的重量低于B6-Co雌性小鼠，其余脏器重量(肠的长度)都大于B6-Co雌性小鼠。雌雄之间眼球、肺、胸腺、肾上腺的脏器指数差异有统计学意见(P<0.05)。

2.3.2 B6-Co表型正常小鼠、B6-Co单眼小鼠和B6-Co双眼小鼠的比较 B6-Co表型正常组与B6-Co单眼组相比较：肺、子宫的脏器指数差异有统计学意义(P<0.05)。B6-Co表型正常组与B6-Co双眼组相比较：肾上腺、子宫、睾丸的脏器指数差异有统计学意义(P<0.05)。B6-Co单眼组与B6-Co双眼组比较：肺和肾上腺的脏器指数差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 血常规、尿常规检测结果

2.4.1 血常规 由表5看出，WBC、MCH、PLT、PCT各组间差异无统计学意义(P>0.05)。

HGB：B6-Co双眼组指标高于其他两组，分别与B6-Co表型正常组和B6-Co单眼组之间差异有统计学意义(P<0.05)。

RBC：B6-Co单眼组的指标小于其他两组，仅与B6-Co双眼组差异有统计学意义(P<0.05)。

HCT：B6-Co单眼组的指标低于其他两组，其与B6-Co表型正常组差异有统计学意义(P<0.05)。

MCV：B6-Co表型正常组、B6-Co单眼组、B6-Co双眼组的指标依次递减。B6-Co表型正常组分别与B6-Co单眼组、B6-Co双眼组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4.2 尿常规 由表6看出仅B6-Co单眼组和B6-Co双眼组之间pH值差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 行为学实验

2.5.1 运动协调能力 因体重大小对运动协调能力有影响，以体重作为协变量进行协方差分析各组小鼠平衡木、抓绳的成绩。

各组平衡木实验分值依次降低(见表7)。经体重协方差分析，3组差异具有统计学意义(F2，27=13.272，P<0.05)。其中B6-Co表型正常组分别与B6-Co单眼组、B6-Co双眼组存在显著差异，三组分值与角膜病变程度呈负相关(rs=-0.585，P<0.01)。

抓绳实验中，B6-Co表型正常组与B6-Co单眼组成绩大致相同，B6-Co双眼组成绩要高于其他两组，但各组分值经协体重分析无统计学差异(F2，27=0.495，P>0.05)。

2.5.2 生活习性 筑巢成绩呈偏态分布，用Kruskal-Wallis H检验法分析各组数据。B6-Co表型正常组成绩要高于B6-Co单眼组和B6-Co双眼组，B6-Co单眼组和B6-Co双眼组成绩大致相同。但各组间差异无统计学意义(χ2=4.544，P>0.05)。

3 讨 论

3.1 繁育性能 与正常B6品系小鼠相比，B6-Co小鼠不育率高，繁殖性能、平均窝产仔数、离乳成活率均低于正常的B6品系小鼠。胎间隔的时间却比正常B6品系小鼠短，这一点应当值得注意。因为大多数文献报道基因突变小鼠的胎间隔比正常小鼠的胎间隔长[9，10]。是否与配种数较少、不育率较高、所统计胎次少等原因有关有待于进一步的观察。由于遗传性角膜病为单基因显性遗传，突变系B6-Co小鼠雌雄交配后不能获得纯合子，为保证突变系的稳定性，本研究设计的配种方式为B6♂ × B6-Co ♀和B6-Co ♂ ×B6♀。对这两种配对方式所产生的后代进行统计：所生的后代总数为147只，其中B6♂ × B6-Co ♀(11对)配对组所生仔鼠突变表型率为47.56%，与显性遗传后代突变表型率50% 的理论值较接近。而B6-Co ♂ ×B6♀(39对)配对组所生仔鼠突变表型率为30.10%，与显性遗传后代突变表型率50% 的理论值有较大差距，其原因还有待于进一步分析和研究。遗传性角膜病小鼠与正常B6小鼠交配后，在其后代中可出现正常表型(理论上即正常B6)、单眼病变和双眼病变的表型。采用不同的交配方式(单眼B6-Co×B6，双眼B6-Co×B6)，其后代均可出现单眼、双眼病变表型。由此可以认为单眼和双眼的遗传效应几乎是相同的，都是同一基因突变所致。

3.2 生长发育 通过生长曲线可以看出B6-Co小鼠在出生后2周内生长发育基本与正常B6小鼠一致，2 w后，其生长发育慢于正常的B6小鼠。2 w左右正是仔鼠睁眼期，B6-Co小鼠睁眼后可能由于其遗传的眼病所带来的视觉障碍，使其采食活动能力受到影响进而影响其生长发育。在观察期间我们发现少数B6-Co小鼠生长发育迟缓，外观看起来相对瘦小，当其6 w时形态上与其他4 w左右的小鼠大致相同，其中一只还伴有畸形。这种情况在正常B6品系小鼠所生的后代中没有发现。提示这种现象与其基因突变有关。

3.3 脏器指数 实验动物的脏器重量和脏器指数是鉴定动物遗传品质的重要依据，是动物实验中常用的重要基础数据。结果表明6 w 时B6-Co雄性小鼠体重和主要的脏器重量要高于B6-Co雌性小鼠，说明B6-Co雄性小鼠的生长发育快于B6-Co雌性小鼠。通过对B6-Co表型正常组、B6-Co单眼组和B6-Co双眼组之间的比较发现B6-Co表型正常小鼠生殖器官的重量和脏器指数均与其它两组差异显著，提示基因的改变可能会影响小鼠的生殖能力。在解剖过程中，分别在B6-Co单眼组和B6-Co双眼组中总共发现4只雌鼠在其肠系膜处长有黄豆大小、黄白色、质地较软的肿瘤。其中一只小鼠腹腔内肿瘤多达4个，其中3个长在肠系膜处，1个肿瘤长在肝门处。提示由于基因的改变可能会增加B6-Co表型异常雌性小鼠肿瘤的发生率。

3.4 血常规和尿常规 血液生理指标中的WBC、MCH、PLT、PCT在各组间差异不显著(P>0.05)，而HGB、 RBC、 HCT、 HCV的指标差异显著，说明B6-Co小鼠在血红蛋白和红细胞这两个主要指标上异于B6-Co表型正常小鼠。B6-Co小鼠尿液的各项生理指标与B6-Co表型正常小鼠相比基本一致。

3.5 行为学实验 遗传性角膜病变小鼠由于角膜病变导致视力较差或丧失，会给日常生活行动等带来一定影响，因此我们进行了部分行为学测试实验。经过实验发现，B6-Co表型正常小鼠与B6-Co单眼组和B6-Co双眼组抓绳成绩未见显著差异，而平衡木的成绩均有差异，且3组的成绩呈下降趋势，经过统计得出平衡木成绩与角膜病变程度呈负相关。实验中还观察到B6-Co表型正常小鼠在平衡木上活动较自如，探索性较强;角膜病变严重的小鼠在测试时间内运动范围较小或基本保持原地不动，完成质量较差。说明了表型异常B6-Co小鼠运动能力基本正常，但在平衡协调性和探索能力方面存在明显不足。从筑巢成绩看：B6-Co表型正常小鼠、B6-Co单眼组和B6-Co双眼组得分呈逐步下降趋势，但无统计学差异。表明B6-Co异常小鼠生活习性上未受到较大影响。

【参考文献】

[1] 薛整风， 茅慧华， 赵 明， 等. ENU诱变获得的3种眼突变模型的研究[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版)，2004，25(4): 68-71.

[2] 邵义祥， 吴宝金， 薛整风， 等. 遗传性角膜基质变性小鼠及其突变基因的定位[J]. 南京师大学报(自然科学版)，2006， 29(2): 99-102.

[3] Deacon RM， Croucher A， Rawlins JN. Hippocampal cytotoxic lesion effecton species-typical behaviours in mice[J]. Behav Brain Res， 2002， 132(2):203-213.

[4] 胡 浩， 杨永坚， 李小平， 等. 铝对小鼠感觉运动行为和生活习性的影响[J]. 中华劳动卫生职业病杂志，2005， 23(2):132-135.

[5] 张静旭， 刘淑霞， 马 丹， 等. NIH小鼠生长繁殖性能的观察[J]. 中国实验动物学杂志，2002，12(5): 292-293.

[6] 王月英， 吴红英， 岳井银， 等. IRM-1小鼠生物学特性的初步研究[J]. 实验动物科学与管理，2004， 21(3):10-12.

[7] 汤百争， 刘 惺， 马亚东. BALB/c-HSF1 knockout小鼠的主要脏器重量， 脏器系数及主要血液生化指标的测定[J]. 中国实验动物学杂志，2002， 12(3):153-156.

[8] 孙岩松， 杨 晓. 不同日龄Smad3基因剔除小鼠的脏器重量及脏器指数[J]. 实验动物科学与管理，2003，20(1): 11-13.

[9] 邵义祥， 陈 兵， 王生存， 等.一种新的突变系短尾小鼠生物学特性观察[C]. 中国实验动物学会第七届学术年会论文集，2006: 132-139.

[10] 孙 伟， 郝光荣， 崔淑芳， 等. 凝血因子IX基因剔除小鼠的生长繁育和主要血液学指标观测[J]. 上海实验动物科学，2002， 22(4):231-233.

[11] 金丽琴， 吕建新， 袁 谦， 等. 细脚拟青霉总多糖对大鼠尿液主要生化指标的影响[J]. 科技通报，2002，18(4):10-13.

[12] 姚丹丹， 黄立胜， 邱俊荣， 等. 板齿鼠的生物学特性及防治对策[J]. 广东农业科学， 2006(5): 52-54.