三种不同方法检测HLA-B27的比较
发表时间：2014-09-05 浏览次数：1776次
1.1一般资料：选择我院门诊或住院AS患者(AS组)120例，其中男88例，女32例;年龄18~45岁，平均31.5岁。均为根据1984年纽约修订的AS诊断标准确诊的患者。选择100例同期来我院体检中心临床无腰背、关节疼痛或僵硬等症状者作为对照组，其中男性66例，女性34例，年龄19~48岁，平均年龄30.5岁。两组一般资料具有可比性。
1.2标本制备：抽取患者晨起空腹静脉血4 ml于EDTA抗凝管中，编号并注明性别、年龄。24 h内分别采用下述三种方法进行HLA-B27检测。
1.3仪器与方法
1.3.1流式细胞仪检测：采用美国BD公司的FACSCalibur 流式细胞仪进行检测，HLA-B27荧光抗体F1(FITC)、CD3荧光抗体F2(PE)、校准微球和溶血素均来自BD公司标准试剂盒。检测时严格按照试剂说明进行，将30 μl荧光抗体(含抗B27和抗CD3)加入到流式分析专用试管底部,再加入抗凝血50 μl,混匀后室温避光15 min,然后加溶血素2 ml,混匀后室温避光10 min,1 500 r/min离心5 min,弃上清加PBS液2 ml,混匀1 500 r/min离心5 min,弃上清加PBS液500 μl,混匀后待测(每次检测之前均使用校准微球通过FASComp软件对仪器进行校准)。
1.3.2实时荧光PCR法：采用博奥生物有限公司生产的晶芯HLA-B27核酸检测试剂盒，严格按照说明书进行操作。采用ABI公司的ABI 7500实时荧光定量PCR检测系统。
1.3.3ELISA法：采用美国LIFEKEY公司生产的HLA-B27检测试剂盒(批号LE041)，将血清作101倍稀释后与系列标准液同时检测，严格按照说明书步骤进行操作，显色后双波长(450/630 mm)比色，根据标准品A值和对应浓度绘制的标准曲线查出各测定管浓度，≥35 U/ml为阳性，﹤35 U/ml为阴性。
1.4统计学分析：采用SPSS15.0软件进行统计学处理，率的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。
2结果
两组血清HLA-B27表达情况见表1，三种检测方法诊断AS的价值参数见表2。
表1两组血清HLA-B27表达情况比较(例)
组别例数RT-PCR法阳性阴性流式细胞法阳性阴性ELISA法阳性阴性AS组1201155112810020对照组100793595694
表2三种检测方法诊断AS的价值参数(%)
检测方法敏感度特异度阳性预测值 阴性预测值RT-PCR法95.8①93.094.394.8流式细胞法93.3①95.095.792.2ELISA法83.394.094.382.5注：与ELISA法比较，①P﹤0.01
3讨论
强直性脊柱炎(AS)好发于青壮年，起病一般较隐匿，早期临床症状较轻，与腰椎间盘突出症、骶髂关节炎、腰背肌筋膜炎等疾病症状相似，且初发者影像学改变不典型，因而在临床诊断上易误诊，失去最佳治疗时机，导致中、晚期出现不可逆的症状，最后发生关节强直甚至致残。国外临床研究证实，HLA-B27抗原阳性与强直性脊柱炎呈高度相关，90%以上的AS患者HLA-B27抗原阳性而正常人群只有8%表达[8]。HLA-B27因而成为临床诊断与鉴别诊断AS的重要辅助指标。在临床检验工作中，选择和使用一种简捷、特异、准确的HLA-B27检测方法显得尤为重要，可以早期诊断早期控制患者病情的发展，减轻畸形的发生[9]。
目前临床检验工作中常用的HLA-B27检测方法为：ELISA法、RT-PCR法、流式细胞法。本研究主要针对以上三种HLA-B27检测方法进行方法学对比研究，探讨各方法的优缺点，为临床检测的选择提供依据。本研究结果显示，三种血清HLA-B27检测方法诊断AS的特异度均较高;PCR法和流式细胞法的敏感度均显著高于ELISA法，其中PCR法略高于流式细胞术，这与文献报道一致。可能是由于PCR法检测是HLA-B27基因型，而血清学检测的是HLA-B27表型，携带HLA-B27基因者细胞表面并不一定有B27抗原表达，因而本研究中PCR法检测为阳性，流式细胞法及ELISA法测定为阴性的标本可能与某些RA患者细胞表面HLA-B27抗原不表达有关。
综上所述，ELISA法是采用酶标记多克隆抗体检测血清中HLA-B27抗原，操作快速简单，无需昂贵的设备，但敏感度稍低，较适合基层医院的使用;RT-PCR法具有较高的敏感度和特异性，但耗时较长，需要特定的实验仪器和严格的实验条件，检测人员需要取得基因扩增技术上岗证才能参加检测工作;流式细胞法具有分析速度快，自动化程度高，可消除人为主观因素影响等优点，同样具有较高的敏感度和特异性，但仪器价格较昂贵，难以在基层医院进行推广。
4参考文献
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[收稿日期：2013-12-09编校：王丽娜]
