喉鳞状细胞癌中MMP1和TIMP1表达的临床病理学意义

作者                 作者单位

张笑盈    天津中医药大学第二附属医院病理科

董稚明    河北医科大学第四医院 河北省肿瘤研究所病理研究室

赵瑞力    河北省肿瘤研究所耳鼻喉科

郭艳丽    河北医科大学第四医院 河北省肿瘤研究所病理研究室

邝钢　　  河北医科大学第四医院 河北省肿瘤研究所病理研究室

The clinical pathological significance of the expression of matrix metalloproteinase 1 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 in laryngeal squamous cell carcinoma ZHANG Xiaoying*,DONG Zhiming,ZHAO Ruili,et al.*Department of Pathology,The Second Affiliated Hospital of TCM University of Tianjin,Tianjin 300150,China

【Abstract】 Objective To investigate the protein and mRNA expression of matrix metalloproteinase1 (MMP1) and tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC).Methods Immunohistochemistry SP method and RT-PCR were used respectively to detect the protein and mRNA expression of MMP1 and TIMP1 in laryngeal squamous cell carcinoma.Results The positive protein expression of MMP1 in tumor tissues of LSCC (82.4%) was significantly higher than that in corresponding noncancerous tissues (18.2%) (P﹤0.05),and mRNA expression of MMP1 in tumor tissues was significantl y higher than that in corresponding noncancerous tissues (P﹤0.05).The positive protein expression of TIMP1 in the tumor tissues of LSCC (72.5%) was obviously lower than that in corresponding noncancerous tissues (95.5%) (P﹤0.05),and mRNA expression of TIMP1 in tumor tissues was remarkably lower than that in corresponding noncancerous tissues (P﹤0.05).The protein and mRNA expression of MMP1 and TIMP1 was correlated with the development of laryngeal squamous cell carcinoma,grade and regional nodal metastasis (P﹤0.05).Conclusion MMP1 and TIMP1 expression is associated with the development,infiltration and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma.

【Key words】 laryngeal squamous cell carcinoma;MMP-1;TIMP-1

侵袭和转移是恶性肿瘤重要的生物学特征之一，是影响预后的重要因素。恶性肿瘤在穿越自然屏障侵袭周围组织并发生远处转移的过程中，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和基底膜(basement membrane,BM)重构是关键环节。在参与ECM降解的酶系中，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhabitor of mettalloproteinases,TIMPs)起到了关键作用。MMPs几乎能降解ECM的所有成分，而TIMPs可以与MMPs结合进而抑制MMPs的降解作用[1]。MMP1属于间质胶原酶，在肿瘤的侵袭和转移中发挥着非常重要的作用[2]。TIMP1可与多种活化的MMPs结合，使其失活或不能活化，与此同时肿瘤侵袭转移的潜能也随之相应的降低[3]。目前，国内外对状细胞喉鳞状细胞癌组织中MMP1和TIMP1表达的研究还比较少，本研究通过免疫组化方法和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法分析MMP1和TIMP1在喉鳞状细胞癌组织中的蛋白和mRNA的表达，探讨其与喉鳞状细胞癌发生发展、浸润及转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取河北医科大学第四医院2006年3月至2008年2月头颈外科手术切除的喉鳞状细胞癌手术切除标本，一部分液氮保存用于RNA的提取;另一部分10%甲醛固定用于免疫组化研究。用于提取RNA的喉鳞状细胞癌标本49例，男47例，女2例;其中取其癌旁组织(距癌边缘1.5～2 cm)15例;用于免疫组化研究的喉鳞状细胞癌标本51例，男49例，女2例;其中取其癌旁组织(距癌边缘1.5～2 cm)22例。

1.2 试剂 RTPCR试剂盒购自Promega公司;Trizol试剂购自北京赛百盛基因技术有限公司;PCR扩增体系采用购自Promega公司的Go Taq Green Master Mix;MMP1和TIMP1抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法检测MMP1和TIMP1在喉磷癌中的表达：全部标本均经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，常规脱蜡水化后，3%甲醇过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，高压抗原分别修复2 min(MMP1)和3 min(TIMP1)。正常山羊血清封闭45 min,依次滴加一抗﹑二抗及三抗，三氨基联苯胺(DAB)显色。抗体为兔多抗，一抗稀释浓度为1∶100，设立阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。在10×40显微镜下观察细胞着色强度，阳性细胞胞浆为棕黄色，根据显色强度分为0～3级[4]：0级：阴性(-)，细胞无棕黄色染色;1级：弱阳性(+)，细胞染色较淡;2级：阳性(++)，细胞中度染色;3级：强阳性(+++)，细胞染色较深。

1.3.2 RTPCR法检测MMP1和TIMP1的mRNA表达：按 Trizol 试剂说明书提取总RNA，并参照逆转录试剂盒说明书的比例加样，将 RNA逆转录成 cDNA。MMP1的上游引物为5’-GAGCAAACACATCTGACCTAC-3’;下游引物为5’-CAAAATGAGCATCCCCTCC-3’，扩增片段长度为264 bp，TIMP1的上游引物为5’-GTTGTTGCTGTGGCTGATAG- 3’;下游引物为5’-TGTGGGACCTGTGGAAGTA -3’，扩增片断长度为266 bp，内参照均为GAPDH，其上游引物为5’-ACCACAGTCCATGCCA-3’，下游引物为 5’-TCCACCACCCTGTTGCTG-3’，扩增片段长度为456 bp。反应条件为：94℃预变性5 min后，94℃ 变性45 s,52℃(MMP1)/58℃(TIMP1)退火45 s,72℃延伸45 s,共 35个循环后，72℃继续延伸10 min。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，用Gel Pro Analysizer 3.1软件，对电泳图像中的表达进行半定量研究。以MMP1或TIMP1条带的光密度值与GAPDH条带的光密度值的比值作为参数，得到相对含量进行分析。

1.4 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以±s表示，采用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验，相关分析采Person法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉鳞状细胞癌中MMP1和TIMP1蛋白在各组中的表达及其与临床病理学特征的关系 MMP1 蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的表达阳性率显著高于癌旁组织(P<0.05)，TIMP1蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的表达阳性率低于癌旁组织(P<0.05)。见表1。MMP1蛋白表达与患者的年龄无关(P>0.05)，但它在中低分化组中的表达显著低于高分化组(P<0.05)，淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)。TIMP1蛋白表达与患者的年龄无关(P>0.05)，它在中低分化组中的表达显著低于高分化组(P<0.05)，淋巴结转移组显著低于无淋巴结转移组(P<0.05)。MMP1和TIMP1在喉鳞状细胞癌中的蛋白表达无相关性(P>0.05)。见表2。表1 MMP1和TIMP1在喉鳞状细胞癌及癌旁组织中的蛋白表达情况例表2 MMP1和TIMP1在喉鳞状细胞癌中的表达及与临床病理的关系 注：与Ⅰ级比较，*P<0.05;与有淋巴结转移比较，#P<0.05

2.2 喉鳞状细胞癌组织中MMP1和TIMP1 mRNA在各组中的表达及其与临床病理学特征的关系 MMP1 mRNA在喉鳞状细胞癌组织、癌旁组织中的相对表达量差异有统计学意义(P<0.05)，TIMP1 mRNA在癌组织中的相对表达量低于癌旁组织(P<0.05)。见表3。随分化程度的降低MMP1 mRNA的表达显著升高(P<0.05)，而TIMP1 mRNA的表达则显著降低(P<0.05);有淋巴结转移MMP1 mRNA的表达显著高于无淋巴结转移(P<0.01)，而TIMP1 mRNA的表达则显著低于无淋巴结转移组(P<0.01);MMP1和TIMP1 mRNA的表达与患者的年龄无关(P>0.05)且MMP1和TIMP1 mRNA的表达无相关性(P>0.05)。见表4。表3 MMP1和TIMP1在喉鳞状细胞癌及癌旁组织中的mRNA表达±s注：与癌旁组织比较，*P<0.05

3 讨论

侵袭转移是恶性肿瘤主要生物学行为之一，恶性肿瘤发生侵袭转移需经过黏附、酶解、移动3个过程[4]。喉鳞状细胞癌表4 MMP1和TIMP1在喉鳞状细胞癌中mRNA的表达及与临床病理的关系 注：与Ⅰ级比较，*P<0.05;与有淋巴结转移比较，#P<0.01的浸润和转移是多步骤、多阶段的复杂过程，涉及肿瘤细胞穿过细胞外基质屏障、血管基底膜及穿出血管壁进入宿主微环境的过程。其中基底膜和细胞外降解是其中的必要条件[2]。在酶解过程中，有很多的酶系统参与，其中最重要的是MMPTIMP这两个酶系统。MMPs 具有很强的细胞外基质降解作用，而TIMPs 则是MMPs 的抑制剂，正常人体中MMPs与TIMPs存在着一种动态平衡,保证了体内生理状态下细胞迁移和细胞外基质重建,一旦调节失控,就成为肿瘤细胞侵袭和转移等病理过程的原因。目前，MMP1和TIMP1与喉鳞状细胞癌发生关系的研究较少。

MMPs是自然进化中高度保守的一类Zn2+依赖性的蛋白质酶家族，广泛分布于植物、脊椎动物、无脊柱动物中。1962 年Gross 和Lapiere 分离出第一个成员胶原酶(collagenase)[5]，此后一系列MMPs家族成员相继被发现，至今已发现有26种以上的MMPs。MMP1属于间质胶原酶，其作用底物主要是Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原[2]，能使其的三股螺旋分子解螺旋，之后被明胶酶继续降解[6]，在肿瘤的侵袭和转移中发挥着非常重要的作用。研究证实MMP1 在食管鳞状细胞癌[7]、宫颈癌[8]、膀胱癌[9]、肺腺癌[10]、胰腺癌、卵巢癌[11]等恶性肿瘤中过表达，并预示较差的预后，Ziober 等[12]采用原位杂交技术证实MMP1mRNA 在口腔鳞状细胞癌中高表达。TIMPs 是一组能抑制MMPs 活性的多功能因子家族，是多基因家族的编码蛋白质，是体内细胞分泌的一类蛋白酶抑制剂，在肿瘤组织与间质细胞中均可表达。它通过对MMPs的抑制，在正常细胞外基质改建和各种病理过程中发挥重要作用。TIMP1是分子量为28.5 kDa的糖基化蛋白，定位于Xp11,能被多种细胞因子诱导产生，广泛存在于组织和体液中。TIMP1可与多种活化的MMPs及非活化的MMP9结合，使他们失活或不能活化[3]。在一些体外实验中已证实，TIMP1mRNA转染的恶性肿瘤细胞，其MMPs活性表达水平降低，与此同时肿瘤侵袭转移的潜能也随之相应的降低[3]。

本研究显示MMP1蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率明显高于癌旁组织，MMP1 mRNA在癌组织中的相对表达量也明显高于癌旁组织，说明喉鳞状细胞癌的发生与MMP1密切相关，这也符合MMP1的表达特点，癌旁组织由于没有发生BM和ECM的重建，所以表达较低。MMP1既可以有效地降解基底膜，又能降解细胞外基质成分，因此我们的研究提示MMP1在喉鳞状细胞癌的局部浸润过程中起重要作用。我们的研究还证实MMP1的表达在中低分化患者较高分化患者要高、在淋巴结阳性患者较淋巴结阴性患者要高，且有统计学意义，提示MMP1可能与喉鳞状细胞癌的远处转移关系密切，与国内张状等[13]采用免疫组化技术检测80 例口腔鳞癌患者MMP1 蛋白表达研究结果一致。本研究显示TIMP1在喉鳞状细胞癌中的表达与MMP1相反，与Wallard等[14] 的研究结果相似，提示在喉鳞状细胞癌中，可能由于TIMP1表达降低，导致其对MMPs 的抑制作用减弱，从而有利于癌细胞的扩散，促进肿瘤的侵袭与转移。

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11 Benbow U,Schoenermark MP,Mitchell TI,et al.A novel host/tumor cell interaction activates matrix metalloproteinase 1 and mediates invasion through type 1 collagen.J Biol Chem,1999,274:2537125378.

12 Ziober BL,Turner MA,Palefsky JM,et al.Type I collagen degradation by invasive oral squamous cell carcinoma.Oral Oncol,2000,36:365372.

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14 Wallard MJ,Pennington CJ,Veerakumarasivam A,et al.Comprehensive profiling and localization of the matrix metalloproteinases in urothelial carcinoma.Br J Cancer,2006,94:569577.