免疫蛋白质组学技术筛选鉴定日本血吸虫雄虫诊断候选抗原

　　目前我国已有几十种血吸虫病免疫诊断试剂，其中一些抗体检测方法具有较高的敏感性，已在血吸虫病防治中发挥了一定的作用。这些检测方法均采用虫卵或成虫粗抗原，其成份复杂，普遍存在着坳、童虫、虫卵可溶性蛋白质中筛选和鉴定了20,22,14个抗原蛋白质。　　本文应用双向凝胶电泳(2-DE)与Western印迹相结合(2-DWestern印迹)、MALDI-TOF/TOF质谱等免疫蛋白质组学技术对日本血吸虫雄性成虫的可溶性蛋白质进行抗原筛选和鉴定，现将研究结果报道如下。　　材料与方法　　一、材料　　1.血吸虫样本及实验动物来源　　日本血吸虫感染的阳性钉螺采自江西都阳湖流行区，由江西省寄生虫病防治研究所提供。健康3月龄新西兰家兔(清洁级)，体重2.5一3.0kg，雄性，由浙江省实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(浙)2008-003302.血清日本血吸虫病患者血清由江西省寄生虫病防治研究所采自粪检阳性患者，并经ELISA检测抗体阳性;健康人阴性对照血清采自本单位职工，无血吸虫病流行区生活史，ELISA检测抗血吸虫抗体阴性。感染兔血清采自本研究室人工感染日本血吸虫尾蝴后42d的家兔，阴性兔血清来自感染前并且粪检虫卵阴性的健康家兔。　　3.实验试剂及仪器　　等电聚焦仪、垂直电泳仪、半干转印仪和PVDF膜(=0.22}m)均为Bio-Rad公司产品。质谱仪4800ProteomicsAnah}zer为ABI公司产品。羊抗兔I步-AP为武汉博士德生物技术公司产品。PCR仪EDC-810为东胜产品。PCR试剂盒、Xh。工、Baml叮限制性内切酶和T4连接酶为TaKaRa公司产品。无细胞表达试剂盒RTSTM100WheatteamCECF为Roche公司产品。质粒提取试剂盒SVMiniprepsDIVAPurificationSystem为Promega公司产品。　　二、方法　　1.雄虫可溶性抗原制备　　取血吸虫阳性钉螺200颗，在30一35℃恒温箱孵育7d，用无菌水洗涤后置洁净烧杯中，加适量的无菌水，在20一250C温箱中光照下逸放尾坳。取尾蝴贴肤感染健康家兔，每兔约2000条。感染42d后用乙醚麻醉感染兔，腹主动脉灌注含肝素生理盐水，门静脉收集虫体。将合抱雌雄成虫分离，挑取雄虫用无菌PBS漂洗5次，最后用细胞水漂洗2次。在冰浴上加细胞裂解液研磨成匀浆，超声处理5min(80W,5s，每次间隔10s，共5次)4℃条件下30000xg离心45min，收集上清，用Bradford法测定蛋白浓度。　　2.双向凝胶电泳　　加去参照文献，采用13cm(pI3-10)IPG胶条，上样蛋白量300pg，水化液体积300pL。等点聚焦设置程序:30V水化12h;500V除盐1h;1000V除盐1h;8000V线性升压8h;8000V快速聚焦35000Vh,500V保持任意时间。SDS-PAGE:将聚焦好的CPG胶条置于12%PAGE凝胶上端，再用0.5%琼脂糖/嗅酚蓝封胶条，220V'恒压6ho凝胶用去离子水中漂洗2次。每次同时同样条件跑3块平行胶，其中2块胶用于作电转印，1块胶进行银染色及质谱鉴定。　　3.Western印迹　　半干湿电转印24V/胶，30min，转印后PVDF膜用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，TBST洗涤3次，每次10min;同一样本相同条件下电泳、转印的2张膜，分别与1:200稀释的感染兔血清和健康兔血清室温孵育1h;`fBST洗膜3次，每次10min;加人1:40000稀释的碱性磷酸酶标记羊抗兔I茄，室温孵育1h;TBST洗膜3次，每次10min后加20mLBCIP/NBT底物溶液，避光反应10min，用20mmol/LEDTA溶液洗涤终止反应，结果扫描保存。　　4.RNA提取　　取50一100mg虫体组织，用1mLTRIzol试剂对组织进行裂解;再加人0.2mL氯仿，12000xg40C离心15min;取上层水相，加0.5mL异丙醇，12000xg4℃离心10min，弃上清;加人1mL75%乙醇进行洗涤，7500xg4℃离心5min，弃上清;待沉淀的RNA自然干燥后，用无RNA酶水溶解RNA沉淀。　　5.目的基因扩增　　按RT-PCR试剂盒说明书操作，将2ML10xRTMix,2MLdNTP,2MLOligodT,l;ML逆转录酶,12ML无RNA酶水和1,}I,模板RNA混匀后，在37℃水浴1h合成虫体cDNA。引物设计:体被抗原上游引物:5'-CCGCTCGAGATGGCGAGTACAATGGAAC-3'，下游引物:5'-CGGGATCCTTAATTGTTTGGTGTACGCC-3';Calcistorin上游引物:5'-CCGCTCGAGATGACTATGAAGCTGCCTGT-3';下游引物:5'-CGGGATCCTCA-GAGTTCATCCTTTATITGAT-3';上游引物均含Xho工酶切位点，下游引物均含BamH工酶切位点。以cDNA为模板，PCR扩增目的基因。PCR反应体系(10FcL):1MLcDNA模板、1pL10}mol/L上游引物、1ML10}mol/L下游引物、1cL10xPCRbuffer,0.8,uL2.5Nxnol/LdNTP,O.1PLTaq酶,5.1uL双蒸水。PCR反应条件:预变性94℃10min、变性94℃30s、退火61℃30s、延伸72℃30s、终延伸720C10min,30个循环。延伸时间按照每分钟合成1000by的速度进行调整。　　6.pIVEXl.4WG,pET-28a重组质粒构建及鉴定　　取PCR产物和pIVEX1.4WG质粒分别进行双酶切，经凝胶电泳鉴定、回收后，按PCR产物:pIVEX1.4WG为0.03pmo1:0.3pmol的摩尔比进行连接，16℃水浴30min。用连接产物转化E.coliDHSa，涂LB平板(含50u剔mL氨节青霉素),37℃倒置培养过夜。挑取单克隆菌落，经菌落PCR、双酶切及基因测序鉴定。将阳性克隆扩大培养，大量提取重组质粒，并浓缩至200ng/;ML。重组质粒和pET-28a质粒经双酶切后回收，进行连接反应，连接产物转化E.coliBL21，涂LB平板(含50;}扩mL卡那霉素),37℃倒置培养过夜，挑取单克隆菌落，进行菌落PCR和双酶切鉴定。　　7.无细胞体系表达目的蛋白　　按PTS}'I100WheatGeamCECF试剂盒说明书操作，在表达体系中加人10p响建的pIVEX1.4WG重组质粒，900r/m24℃培养24h，收集表达产物上样至两块SDS-PAGE胶，一块胶用于考马斯亮蓝染色分析，另一块胶转膜后进行Western印迹检测。　　8.原核诱导表达目的蛋白并纯化　　成功转化pET-28a重组质粒的阳性克隆接种至含卡那霉素的LB培养基，37℃培养过夜，再按1100转接LB培养基，继续培养至I'630nm吸光度约为0.6，加IPTG至终浓度为0.Smmol/L，诱导表达4h，离心收集菌体，加裂解液后置冰浴超声处理，120W,12s共30个循环。30000xg离心45min，收集上清，用Niagarose亲和层析纯化重组蛋白。　　结果　　一、日本血吸虫雄虫可溶性蛋白质2-DE和2-D　　Western印迹结果用2-DE分离日本血吸虫雄虫可溶性蛋白，感染兔血清Western印迹检测，膜上检出201个阳性反应点;在2-DE胶图上找到36个匹配的蛋白质点，其中12个点同时也能与健康阴性兔血清反应，提示为非特异性抗原蛋白质(图1见封三，由红色虚线圈标示);筛选获得的24个特异的抗原蛋白质点相对分子质量在10000一75000之I司，集中在2000037000;蛋白质pI分布在3一9之间，集中在5一7.　　二、日本血吸虫雄虫抗原蛋白质点MALDI-TOF,TOF串联质谱鉴定结果24个日本血吸虫雄虫抗原蛋白质点经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定，79.20}o(19/24)鉴定成功，并在NCBI数据库中找到匹配的蛋白质信息资料，其中14个有蛋白质相关功能信息(表1).　　三、日本血吸虫雄虫体被抗原、ERCalcistorin重组质粒构建与蛋白表达根据NCBI数据库，日本血吸虫体被抗原基因为558bp(GenBank:FN326913.1),编码蛋白质相对分子质量为21800;ERCalcistorin基因为1455by(Gen-Bank:FN314047.1)(图2a)，编码蛋白质相对分子质量为54800。构建的pIVEX1.4WG体被抗原、ERCaI-cistorin基因重组质粒经PCR和Xb。BamH工双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小正确。PCR产物测序结果显示，目的基因正向插人pIVEX1.4WG载体，且无氨基酸编码突变。　　麦胚无细胞体系中表达产物经SDS-PAGE与抗-His抗体免疫印迹结果表明，体被抗原和ERCalcis-torin重组蛋白均正确表达(图2b)o四、Western印迹检测麦胚无细胞体系表达重组蛋白的抗原性Western印迹检测日本血吸虫病患者血清与健康人血清各10份，结果用QuantityOn。分析(设置RollingDiscSize为10)，体被抗原能检出9份患者血清(2一9,11)，敏感性为90%，而未见与阴对照血清反应出现假阳性，特异性为100%;ERCalcistorin仅能检出6份患者血清(2一7)，敏感性为60%,2份阴性对照血清出现假阳性(15,21)，见图30五、血吸虫体被抗原重组蛋白的原核表达构建的体被抗原基因pET-28a质粒经成功转化E.coliBL21表达菌，经IPTG诱导表达相对分子质量为21800的重组蛋白，并且表达的重组蛋白大部分在细菌裂解液上清中，提示表达的重组蛋白可溶性较好(见图4)。原核表达的重组蛋白不仅能与血吸虫病患者血清反应，也能与健康人的阴性血清发生非特异性结合(图Sa,b)，不具有特异性。　　讨论　　日本血吸虫生活史较为复杂，其中与人体感染直接相关的有尾坳、童虫、成虫、虫卵4个时期。近几年多个研究小组完成血吸虫不同期别、不同性别的差异蛋白质组学研究，结果表明不同发育期、雌雄成虫间不仅形态差异较大，蛋白质表达也存在差异〔}_yi。血吸虫成熟雄虫有独特的抱雌沟，把雌虫包裹在沟内，因此，与雌虫相比雄虫的体表与人体免疫效应分子的接触概率更高，推测雄虫拥有更多具有诊断价值的抗原分子。本研究从雄虫可溶性蛋白质组中筛选获得24个能与感染兔血清特异性反应的蛋白质，均高于尾坳(20个)、童虫(22个)、虫卵(21个)，明显高于雌虫(17个)可分离的特异性蛋白质〔4一5}。Zhong0等用相同的方法从日本血吸虫成虫(雌雄混合)可溶性抗原中筛选鉴定了10个抗原蛋白质点，为亮氨酸胺肤酶、果糖二磷酸醛缩酶、谷胧甘肤硫转移酶(GS'I'),22600皮层抗原等4种蛋白及其异构体。本文成功筛选鉴定了19个抗原蛋白质，其中包括GST,22600皮层抗原、脂肪酸结合蛋白等广受关注的血吸虫病候选抗原分子}1-m，有4个蛋白质是异构体，1个未知蛋白质。新筛选鉴定的其他抗原蛋白质的免疫原性还有待于进一步研究。　　重组蛋白表达系统有原核表达、真核表达、杆状病毒一昆虫细胞表达、哺乳动物细胞表达以及无细胞体系表达等，每一种表达系统均有其优点和不足之处，制备诊断抗原选用哪一种体外表达系统取决于其蛋白质抗原决定簇的特性。麦胚提取物无细胞表达系统已‘广泛应用于酶、抗原和微阵列蛋白芯片等领域，其优势是可用于表达具有细胞毒性、易形成包含体或易被细胞降解的重组蛋白，可人为控制反应条件及蛋白翻译后修饰，便于进行分子标记等后续蛋白研究。本文选用麦胚无细胞体系表达筛选出的体被抗原和ERCalcistorin，结果提示用该体系表达的体被抗原的敏感性和特异性分别达到90%和100%，是潜在的血吸虫病免疫诊断抗原的表达体系，具有进一步开发应用价值;而ERCalcistorin重组蛋白的敏感性仅为60%，特异性为80%，抗原性较差，可能与蛋白未能正确折叠有关。用同样的体被抗原基因构建原核表达质粒，经IPTG诱导可获得大量重组蛋白，但Western印迹检测结果显示，原核表达的体被抗原特异性差，不适合用作诊断抗原，这可能也与原核表达的重组蛋白在细菌内未能正确折叠有关。　　日本血吸虫体被是虫体与宿主直接接触的生理界面，在营养吸收、免疫逃避以及渗透压调节等方面起重要作用，因此血吸虫体被蛋白一直是研究热点。　　已发现的四跨膜蛋白、22600皮层抗原、脂肪酸结合蛋白等体被蛋白均能诱导动物产生一定的免疫保护性[lML。本研究从成虫蛋白质组中筛选出的体被抗原，同样也已在尾坳蛋白质组中筛选到16J，该体被抗原是否具有早期诊断价值和免疫保护性值得进一步深人研究。　　参考文献　　Xu J,Peeling R(). Ch() of immunoassays for the diagnosis of Schistosoma japonicum infection using archived sere[J].PLoS Negl Trop Dis,2011,(01):e949.　　Bakry R,Rainer M,Huck CW. () profiling for cancer biomarker discovery using matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spect()() a review[J].Analytica Chimica Acta,2011,(01):26-34.　　López-árias E Aguilar-Lemarroy A,Felipe Jave-Suáuez L. Alpha l-antitrypsin:A novel tumor-associated antigen identified in patients with early-stag() cancer[J].Eiectrophoresis,2012,(14):2130-2137.　　马安,刘晓龙,()小(). 免疫蛋白质组学技术在血吸虫病研究中的应用[J].国际医学寄生虫病杂志,2011,(05):281-285.doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4122.2011.05.007.　　王越,杨再峰,马安. 应用免疫蛋白质组学方法鉴定日本血吸虫虫卵诊断抗原[J].中国人兽共患病学报,2011,(10):861-881.doi:10.3969/j.issn.1002-2694.2011.10.002.　　马安,王越,丁小仙. 日本血吸虫尾蚴及童虫可溶性抗原蛋白质组研究[J].国际流行病学传染病学杂志,2011,(04):229-234.doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4149.2011.04.005.　　Hong Y,Sun A,Zhang M. Proteomics analysis of differentially expressed proteins in schistos() and aduit () japonicum[J].Acta Tropica,2013,(01):1-10.　　Cheng GF(). Proteomic analysis of differentially expressed proteins between the male and female worm of Schistosoma japcaicu[J].2005,(02):511-521.　　Curwen RS. () man soni soluble ()cteome:a compatson() across four life-cycle stages[J].Mol Biccnemi Parasitol,2004,(01):57-66.　　Zhong ZR. ()proteome-oriented ()of antigens for the diagncsis of Schistosomiasis japonica[J].Acta Tzop,2010,(01):1-8.