建立基于超薄切片的高分辨成像技术解析组织的精细空间结构

对于生物组织精细结构的观察和分析是理解其生物学功能的基础。一方面,对于正常组织的精细结构分析有助于我们理解其工作的原理;另一方面,对于病变组织结构的分析,如对于肿瘤精细结构的分析,能够为理解肿瘤的发生和发展过程提供研究基础和线索。传统显微镜的分辨率在Ⅹ轴和Y轴约250nm,而Z轴的分辨率约700nm,实际成像分辨率在1um以上。Z轴分辨率比Ⅹ、Y轴的分辨率差很多,影响了成像的清晰度,同时在进行空间三维重构时会发生图像扭曲。电子显微镜有分辨率高的优点,如果对系列切片进行成像和三维重构,工作量过大而难以进行。而且电子显微镜制样过程容易对抗原产生破坏,抗原的标记识别具有一定的局限性。近年来普通光学显微镜与新的分子标记方法、样品制各方法、计算机辅助成像以及图像处理和分析方法结合,为组织的三维空间高分辨成像提供了可能性。美国斯坦福大学⒌ephenJsmith实验室发展了一套高分辨三维成像技术,组织用亲水性树脂渗透和包埋后,利用钻石刀将包埋的组织切成50~500nm的连续切片,对连续切片进行多重抗体标记后成像,经过图像的二维拼接和三维重构,获得一定体积空间内的蛋白定量信息。该技术获得了比激光共聚焦显微镜更高的分辨率,同时克服了传统制片中抗体渗透不足的缺点,获得空间内均一和可靠的蛋白定量信息[l]。研究者利用该项技术精细描绘了小鼠脑皮质层树枝状结构和树突棘 [2],以及脑的神经环路 [3]。华中科技大学骆清铭教授的实验室利用钻石刀对已标记的小鼠脑组织进行连续半薄切片和实时成像,获得小鼠全脑的高分辨三维结构[4]。 Soza-Ro11y等 [5]利用该技术定量测量了小鼠脑中缝背核的谷氨酸在三维空间里的分布。saatchi等 [6]利用该技术,结合多抗体标记方法在小鼠模型中对腹主动脉瘤发展过程中的血管壁微结构和细胞的形态进行了细致地三维空间解析。目前,高分辨的组织三维重构技术多数应用于小鼠脑神经结构的研究。本研究结合染色和多重抗体标记方法,建立了一套基于连续超薄切片的三维成像技术,对人正常结肠组织、小鼠肝脏和脑组织进行了二维和三维的成像,获得组织高分辨的生物信息,所建立的方法对于组织的三维空间高分辨成像具有通用性,并为超高分辨显微成像提供了Z轴的解决方案。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器戊巴比妥钠、HBSS粉末,PBs粉末、T凶s缓冲盐片剂、蔗糖、甘氨酸、甲基蓝、碱性洋红、乙醇和一抗monocIona1antiˉαˉTubu1inantibody(Sigma);8%多聚甲醛(电子显微镜级)(Elec扪nMicros∞盯⒌iellces);牛血清白蛋白(BSA)、二抗TEⅩAsRED⑧anh-mc,ube坨G(H+L)和封片齐刂(Ⅴec·tasheldmountingme山umwithDAPI)(Vector)。 HB“缓冲液的配制:9.5gHBSS溶于10O0mL 水中,加2.38gHEPES,用NaoH将缓冲液的pH值调到7.2。 PBS缓冲液的配制:将一袋PBS粉末溶于 50OmL水中,形成0.02mol/L的PBS缓冲液。固定液的配制:0.01md/LPBS缓冲液中含有4%多聚甲醛和2.5%蔗糖c洗涤缓冲液的配制:0.01mo1/LPBS缓冲液中含有3.5%蔗糖和50mm。l/L甘氨酸。 Tris缓冲体系:将一片T五s缓冲盐片剂溶解在15mL水中。洗脱液的配制:3.6mL水中溶有26uL2·5%高锰酸钾和1uL18md/L硫酸。 LeicaEMKMR3制刀机、钻石刀JtlmboHistoDiamondKn浼(Diatom);Le妃aEMUC7超薄切片机(Leica);Nikt,l1△-E全自动倒置显微镜(N依on)。

1.2方法

1.2.1组织固定、脱水和包埋人正常结肠样品(癌旁样品)由上海交通大学附属瑞金医院提供,在4℃HBss缓冲液中切成1mm×1mm×1mm左右,直接放人固定液(4%多聚甲醛)中常温固定3h。固定完成后,用冷的洗涤缓冲液洗2~3次,共30血n。用乙醇进行梯度脱水,50%、70%、 Q~s%、 100%乙醇各脱水5m血。100%乙醇与LRWhite树脂1△混合后处理样品5m血,换成LRWhite树脂处理2次,每次5m血。样品在新的LRWh仉树脂中处理过夜。次日,将组织放在明胶管中52℃聚合叨h。小鼠肝脏组织和脑组织取自实验用昆明鼠。小鼠注射麻醉剂后处死,迅速取出肝脏和脑组织置于HBSs缓冲液(4℃)中，在缓冲液中切成约1mm×1mm×1mm的小块,在固定液(4%多聚甲醛)常温固定3h。后续步骤与人正常结肠样品处理方法一致。

1.2.2组织超薄/半薄连续切片聚合好的组织进行修块,用JttmboHistoDiamondKni允将修好块的组织切成⒛0~1000nm的半薄连续切片。用小睫毛将水面漂浮的连续半薄切片牵引到插人水槽的玻片上,轻轻将玻片提起,上面平整贴有连续的切片。将贴有连续切片的薄片在ω℃烘箱中放置30min后,室温下储存。

1.2.3超薄切片染色在75℃的热板上用甲基蓝染色⒛s,随后用碱性洋红的50%乙醇溶液染色10s。通过调节染料染色的时间可以调节组织的染色效果。

1.2.4多重抗体标记用油性笔在切片外缘做标记,使得液体不会外溢。将4mg甘氨酸溶解在1mLTⅡs缓冲液中,取一部分液体加在切片上室温水合5min,用Ths缓冲液洗数次。将一抗m。n。clonalahti-α习ubuIinantibody(⒈50稀释到1%BSA的T1·is缓冲液中)加至刂切片上室温作用2h,用TⅡs缓冲液洗数次。将二抗TEⅩASRED⑧a而-mt,Ll∞坨G(H+L)(⒈1O0稀释到1%BSA的TⅡs缓冲液中)室温避光作用30min。用Ths缓冲液洗数次,最后用水洗 1次 ,加上带DAPI的封片剂进行封片。如果要进行多重抗体标记,在成像结束后将盖玻片取下,洗掉封片剂,洗脱液室温作用90s,用水洗去洗脱液,并将水甩干。待切片干后,在50℃干燥30m血,随后进行第2次抗体标记。

1.2.5自动化成像、图像处理、二维拼接和三维重构基于NikonTi-E全自动显微镜和开源软件umanager[7],实现对连续切片的自动化成像。在手动选择切片区域的位置坐标后,系统自动完成切片的取图和存储。根据分辨率要求,分别选择100×(数值孔径1,4)和硐*(数值孔径0.60)的镜头成像。采用Nikon的完美聚焦系统(pe1·fectfocus叩stem,PFS)防止连续取图中的焦点漂移。系统采用Qima驴ngReuga~翎o0R制冷单色CCD获取数字图像。对于甲基蓝和洋红染色的切片,基于三原色叠加实现彩色图像的原理,分别获得红、绿、蓝三个通道的图像后叠加得到彩色的图像。为了进行图像拼接获得大尺寸的切片图像,在取图时设定连续2幅图像之间有不小于图像尺寸的10%的重叠。获取图像后,首先对图像进行去背景和均一化等必要的处理,以减小不同切片间信号的差异。在此基础上,使用基于傅里叶变换的相位相关方法L:J,确定连续图像间实际重叠部分的大小,并根据取图的顺序将二维切片的图像进行拼接,最终获得所有切片的二维图像。在三维重构之前需要进行图像配准。因为连续切片在经过切割、染色、成像等处理后,已经在空间上失去了精确的连续性,必须将相邻的连续切片在空间上进行配准。目前我们用的变换形式为旋转和平移。切片图像经过配准后,就可直接进行重构获得三维结构信息。图像处理、二维拼接和三维重构都是基于开源软件F刂i[9]完成。

2结果

2.1人正常结肠半薄切片染色高分辨图像分析对人正常结肠组织(癌旁样品)进行半薄切片和甲基蓝一洋红染色,获得比传统石蜡切片清晰度更高的图像。临床病理常用的苏木精-伊红染色,由于苏木精的分子量大,难以进人树脂,故改换成甲基蓝一洋红染色。图1显示的人正常结肠组织上皮部分,肠腺中的肠系细胞和杯状细胞清晰可见,杯状细胞顶部的分泌颗粒被洋红染成深粉红色,包裹在染成较深红色的膜内。杯状细胞内能看到糖原和线粒体。黏膜固有层内的黏液、淋巴管和毛细血管清晰可见,还观察到hneth细胞。将洋红的染色时间减少2s,整体染色效果偏蓝色,细胞与细胞之间的空隙清晰可见,能分辨出一些细胞之间的连接。注:A甲基蓝染色⒛s,洋红染色10s,×⒛0;B甲基蓝染色⒛s,洋红染色10s,×lO00;C甲基蓝染色⒛s,洋红染色8s,×1000c图1人正常结肠组织的半薄切片(1000im)甲基蓝-洋红染色图Fig1MethyleneblueandbasicfuchsinstainingofhumannormalcoloⅡtissuesemiˉthincut住ngsⅡces(1000nm)

2.2小鼠肝脏组织的半薄切片染色和三维重构经过甲基蓝-洋红染色的小鼠肝组织半薄切片(1000nm)呈现出比普通冰冻或石蜡切片更清晰的结构。图2A~C显示,肝细胞呈现典型的多角形结构,胞质显示深蓝紫色,细胞核呈亮蓝色,部分肝细胞显示双核结构,从细胞核中能看出核仁的分布,细胞外的结缔组织呈现淡粉紫色。肝细胞之间的间隙非常清晰,平滑而紧致。肝细胞与胆小管或肝血窦之间的接触面能看到有微绒毛结构。肝血窦区域中,窦壁的内皮细胞核也染成亮蓝色。Kuffer细胞核染成亮蓝色,周边呈紫红色,位于肝血窦中。其中图2D显示肝脏的门管区和外包结缔组织,血细胞和血液中的免疫细胞、小叶间静脉、内皮细胞、薄层结缔组织和散在的平滑肌纤维清晰可见。利用钻石刀将树脂聚合的组织切成10O0nm的连续半薄切片(图3)，对连续切片进行全自动光学成像,将⒛张小鼠肝脏组织半薄切片进行二维拼接和三维重构,得到一小块肝脏组织的高分辨三维重构图,从三维重构图中可以看到肝脏的精细空间排布

2.3小鼠脑组织超薄切片的多重荧光标记和三维空间重构将小鼠的脑组织切成⒛0nm的连续超薄切片,在超薄切片上进行微管蛋白的抗体标记,细胞核用DAPI进行标记。图5显示了多重荧光标记技术,已标记上的微管蛋白抗体经洗脱后能重新标记上,而DAPI洗脱后不能标记上。利用该技术可以对同一个三维空间标记多种抗体,而相互之间的信息不干扰。图6显示,将I3张⒛0nm小鼠脑组织的连续超薄切片经二维拼接和三维重构后,微管蛋白在三维空间中的分布清晰可见。

3讨论

本研究建立了基于超薄切片的三维高分辨成像技术,主要通过超薄切片方法提高传统显微镜的Z轴分辨率。该技术采用亲水性强的丙烯酸树脂LRWh⒒e进行样品包埋,该树脂易于进行抗体标记，将包埋在树脂中的组织切成连续超薄或者半薄切片(50~1000nm)排列在一张玻片上,利用现代光学显微镜以及连续成像系统对每一张切片进行成像,通过二维拼接和三维重构技术对一定体积的组织进行高分辨的三维精细结构分析。利用该技术,我们对人正常结肠组织、小鼠肝脏和小鼠脑进行了高分辨的成像。从获得图像的清晰度来看,成像分辨率介于传统显微镜和电子显微镜之间,但是利用该技术进行一定体积组织的三维空问高分辨成像,比电子显微镜具有明显的优势。与冰冻切片和石蜡切片相比,该技术具有Z轴的高分辨率,而且通过一次连续自动切片,能获得上百张的连续切片,工作量较小。

由于临床病理常用的苏木精相对分子质量较大,不易进人树脂的空隙,我们采用甲基蓝和洋红进行组织染色,该染色产生的特点和苏木精-伊红染色有一定的区别。如甲基蓝-洋红染色可以将结肠的杯状细胞染成粉红色,比苏木精-伊红染色更容易识别。在获得的高分辨图像中,细胞与细胞之间的边界以及空隙清晰,为后续细胞与细胞之间相互作用的研究提供了结构基础。

多重抗体标记技术可以将已标记的抗体从树脂中洗脱出来,不影响抗原的结构;可以进行下一次抗体标记,使得对同一组织空间进行多种抗原的空间定位成为可能,避免了不同抗原空间定位之间的干扰。

基于超薄切片的三维重构技术也可用于解决超高分辨的Z轴分辨率问题。近几年超高分辨成像技术得到了飞速发展,基于非线性光学的成像技术已经说明用可见光波长可以达到亚100nm的分辨率而基于可开关荧光标签的方法可以将荧光分子定位在10nm。目前,这些超高分辨的技术还限于提高横向的分辨率上,如果要在三维空间实现超高分辨,连续超薄切片技术可以帮助解决三维空间纵轴的分辨率。

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