药用植物与丛枝菌根真菌的选择性侵染研究

丛枝菌根(arbuscular mycorrhizas,AM)为分布最广泛的菌根类型。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)可以与80%的陆生植物形成AM共生体[1]。AM的形成不仅可以增强植物的氮、磷营养的供应,还可以增强植物在多种胁迫环境下的抗逆性[2],增强植物的生物量及有效成分[3-6]。AM的功能与其结构紧密相关,AM与植物共生体的根内结构形成了植物与真菌的物质交换层,根外菌丝则是真菌从土壤中吸收养分的基础[7]。AMF对植物的侵染过程包括一系列的相互识别过程。AM孢子萌发后,菌丝不断分枝呈扇形生长分布,在与植物根接触后,AMF在植物根的表面形成附着胞。附着胞在AMF产生的识别信号物质与植物产生的识别信号物质相互识别后,进入植物根内[8]。有的菌丝进入植物细胞,并且形成连续二岔状分支,即丛枝结构(arbuscular)。其根外菌丝则进入土壤吸收矿质营养。在与植物共生1个月左右时菌丝会生成泡囊或孢子。由于AM与植物之间存在选择性,因此,不同的菌种侵染相同的植物结果可能不同,而相同的菌种侵染不同植物结果也有可能不同。明确二者之间的选择关系对药用植物AM研究十分重要。本研究用6种AMF对4种药用植物进行了侵染试验,并且用频率法测定了AMF的侵染率,得到了4种药用植物与6种AMF的选择性规律。该试验可以对药用植物AM研究提供指导和参考。1 实验材料土壤准备,土壤采集于中国医学科学院药用植物研所实验基地10～30 cm表层土。土壤高压湿热灭菌121 ℃灭菌90 min,晾晒2 d后,过筛,继续翻动晾晒5 d以上,至干。黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)种子,采自山东;疏柔毛罗勒(Ocimum basilicum non L.)种子,来源于安徽阜阳;青蒿(Artemisia annua L.)种子,来源于广西;苍术(Atractylodes lancea (Thunb) DC.)种子,来源于江苏。检测发芽率均高于80%,种子活力良好。菌种来源：北京市农林科研院丛枝菌根资源库地表球囊霉(Glomus versiforme,G.V),聚丛球囊霉(Glomus aggregatum, G.A),摩西球囊霉(Glomus mosseae,G.M),根内球囊霉(Glomus intraradices,G.I),缩球囊霉(Glomus constrictum,G.C1), 近明球囊霉(Glomus claroideum,G.C2)。试剂：10%KOH,1%H2O2现用现配,2%HCl,乳酸酸性品红染色液(每升含乳酸875 mL、酸性品红0.1 g、甘油63 mL、蒸馏水62 mL),脱色液(每升含乳酸875 mL、甘油63 mL、蒸馏水62 mL),FAA固定液(60%酒精∶冰乙酸∶40%甲醛=8∶1∶1,V∶V∶V),300 μm、50 μm分样筛。数码显微成像系统：显微镜Olympus BH-2,成像Anymicro DSS YT-5M Digtal shoot system,目镜10×,物镜20×,普通光源,原色模式。2 实验方法种子表面灭菌：黄芩、苍术、青蒿、罗勒种子净选后置于流水中冲洗1 h,然后用75%乙醇快速灭菌30 s,放入10%H2O2灭菌10～20 min,无菌水冲洗数次。25 ℃催芽24 h后备用(苍术15 ℃避光催芽7 d)。接种条件：取400 g灭菌土壤至500 g花盆中,加入AM菌剂,菌剂用量1%,敷少量土壤,播入种子,使种子位于菌剂的正上方,再覆土约100 g。培养条件：光照0～144 μmol/(m2?s);人工气候室温度15～25 ℃;播种时加水125 mL至水分饱和,待植物生长稳定后,水分保持土壤饱和含水量的70%;栽培周期2～3个月,收获。将根流水冲洗干净后,置于FAA固定液中保存,待测。根的测定前处理：将植物根系展开均匀取样。剪取50根以上长约1 cm根段,先放入10% KOH于90 ℃水浴加热20～100 min,1%H2O2漂白数次,放入2%HCl酸化,然后至乳酸酸性品红染色液染色,置分色液中分色,将根段排于载玻片上,加入2滴乳酸液后加盖玻片,观察。　　侵染率的测定标准：侵染率的测定可以通过观察菌丝、丛枝、泡囊来实现。本研究采用的是综合测定的方法,即在一段根内只要发现菌丝、丛枝、泡囊中的任何一种即记为侵染。计算侵染率。处理见表1。表1 4种药用植物的测定前处理3 结果经过染色处理后发现,植物组织几乎为透明,在皮层细胞中可见横走的菌丝;部分皮层细胞内部见丛枝分布,在高倍镜下可见丛枝为菜花状结构;泡囊有菌丝连接,为膨大的近球形结构,泡囊为孢子的前体,有的根段可见泡囊分布。根外可见有菌丝分布,部分菌丝可见连接成熟的厚壁孢子。对湿筛法获得的孢子进行显微照相,见图1。按频率根段法测定6种AMF对4种药用植物的菌根侵染率,结果见表2,并用显微数码拍摄系统对植物根侵染进行拍照,见图2。G.A孢子 G.I孢子 G.V孢子G.C 1孢子 G.C 2孢子 G.M孢子图1 湿筛法获得6种菌根侵染照片表2 6种AMF对4种药用植物的侵染率图2 4种药用植物6种菌根侵染照片(部分)4 讨论4.1 不同药用植物的处理方法由于样品不能及时测定,因此,本试验所有样品均用FAA固定液进行了固定。在实际操作中,如果样品可以直接测定,该过程可以省去。10%KOH透化的时间视材料的厚度而定,如果根的质地较硬,那么该时间可以适当加长。1%H2O2漂白的时间长短和次数均视材料的颜色而定,一般3次漂洗可以使植物根系变白。酸化时间不固定,只要保证材料被均匀酸化即可。染色时间和温度与分色时间和温度应相对应：一般情况下90 ℃、20 min可以染色充分,分色可常温过夜分色,或高温分色1 h以上。在分色和制片过程中应避免材料与水接触引起真菌材料的脱色。几种受试材料中,黄芩、罗勒、青蒿的根粗细较为适中,因此采用较短的10%KOH透化时间,而苍术的根较粗,适当加长了10%KOH透化时间。在进行黄芩测定时,按照农业上的方法测定,结果发现黄芩的根颜色较重。因此,试验中加长了10%KOH透化时间,并且加长了1%H2O2浸泡时间,透明效果较好。另有报道以1%碱性H2O2(30 mL 10%H2O2,3 mL NH4OH,570 mL蒸馏水)软化植物根,该步骤对幼嫩根可以省去[9],但试验中发现1%H2O2漂洗可以使植物根漂白,去除杂色的干扰,因此保留了此步骤。不过H2O2有使植物根内产生气泡的缺点,在制片和拍照过程易产生干扰。4.2 药用植物与AMF的选择性和规律性由结果可知,不同菌种对同一植物的选择性不同,而且差异较大;不同植物对相同菌种的选择也存在明显差异。造成这种差别的原因可能是因为某些菌种的侵染对象范围较窄。例如,在试验中G.C2在不同植物的上表现出的差异性较大,可能与其对植物的选择性相关。因此在进行药用植物的特定AMF接种试验时应考虑二者的选择性,选择适当的对象进行侵染培养。AMF与药用植物的侵染还存在一定的规律性,即同一菌种和对不同植物均表现出了较高的侵染水平。例如,G.M、G.I,对不同植物均表现出了较高的侵染率,这也与其他报道相一致[10],G.M、G.I的这种特性可能与其对植物的普遍适应性相关。因此在药用植物的共生AMF本底不明的情况下,可以用这2种AMF进行侵染试验。【参考文献】[1] Smith SE, Read DJ. Mycorrhizal symbiosis[M]. Cambridge,UK：Academic Press,1997.[2] 郭兰萍,汪洪钢,黄璐琦,等.泡囊丛枝菌根(AM)对苍术生长发育及挥发油成分的影响[J].中国药用植物杂志,2006,31(18)：1491.[3] Rosa Porcel, Ricardo Aroca, Rosario Azcón, et al. PIP aquaporin gene expression in arbuscular mycorrhizal glycine max and Lactuca sativa plants in relation to drought stress tolerance[J]. Plant Molecular Biology,2006,60(3)：389.[4] Marcel Bucher. Functional biology of plant phosphate uptake at root and mycorrhiza interfaces[J]. New Phytologist,2007,173(1)：11.[5] Kaldore M, Kuhn, AJ, Schr?der WH, et al. Selective element deposits in maize colonized by a heavy metal tolerance conferring arbuscular mycorrhizal fungus[J]. Journal of Plant Physiology, 1999,154(5/6)：718.[6] M Miransari, HA Bahrami, F Rejali. Using arbuscular mycorrhiza to alleviate the stress of soil compaction on wheat (Triticum aestivum L.) growth[J]. Soil Biology and Biochemistry,2008, 40(5)：1197.[7] 中国农业百科全书编辑部.中国农业百科全书：土壤卷[M].北京：中国农业出版社,1996.[8] Akiyama K, Hayashi. Strigolactones：chemical signals for fungal symbionts and paraitic weeds in plant roots[J]. Annals of Botany,2006,97(6)：925-931.[9] 严小龙.根系生物学原理和应用[M].北京：科学出版社,2007.[10] Paul-Olivier Redon & Thierry Béguiristain. Differential effects of AM fungal isolates on Medicago truncatula growth and metal uptake in a multimetallic (Cd, Zn, Pb) contaminated agricultural soil[J]. Mycorrhiza,2009,19(3)：187-195.