中药对肾小球硬化大鼠模型细胞外基质的影响

作者              作者单位

于克波  泰山医学院附属医院肾内科，山东 泰安 271000

王太华  泰山医学院附属医院肾内科，山东 泰安 271000

Influence of traditional Chinese herbal medicine on extracellular

matrix in Adriamycininduced glomerulosclerosis ratsYU Kebo，WANG Taihua

(Affiliated Hospital of Taishan Medical College, Taian City 271000, China)

Abstract:Objective: To explore the influence of traditional Chinese herbal medicine on extracellular matrix in Adriamycin induced glomerulosclerosis rats. Methods: 120 Male Sprague Dawley rats were divided into Groups of A, B, C, D, E, F and G randomly. The rats in the B, C, D, E, F and G groups were subjected to surgical ablation (SNX).The Groups of C, D, E, F and G were treated with Adriamycin to induce glomerulosclerosis. The Groups of E, F and G were given different traditional Chinese herbal to investigate the efficacy of them. Collagen Ⅲ and collagen Ⅳ were assessed using immunohistochemistry. Results: The collagen Ⅲ, collagen Ⅳ expression in the Groups of E, F, and G were reduced compared with Group D. Conclusion: The traditional Chinese herbal medicine can reduce the collagen Ⅲ, collagen Ⅳexpression and retard the development of glomerulosclerosis.

Key words:glomerulosclerosis; traditional; Chinese herb; collagen Ⅲ;collagen Ⅳ

肾小球硬化是多种原因引起的肾小球损伤后出现的共同转归，是肾功能衰竭主要的病理基础。近年来研究表明细胞外基质(ECM)在肾小球硬化发生发展中起着重要作用。细胞外基质的主要成份是胶原，其中Ⅲ型胶原正常仅存在于肾间质和肾小球外大血管，Ⅳ型胶原则位于基底膜和系膜区，胶原组织过度产生，致肾单位相继破坏，最终导致慢性肾功能衰竭[1]。因此治疗肾小球硬化关键是抑制肾组织内ECM(Ⅲ、Ⅳ型胶原等)的合成。本研究通过观察中药对肾组织中Ⅲ、Ⅳ型胶原的影响，来评价不同中药成方对肾小球硬化的治疗效果，筛选出对肾小球硬化有治疗效果的中药成方，为中药成方治疗肾小球硬化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

SD雄性大鼠120只，2月龄，体重220～250克左右，由山东省防疫站实验动物饲养中心提供。随机分组如下：A组：正常对照组6只;B组：右肾切除术后对照组6只;C组：肾病对照组8只;D组：肾硬化对照组20只;E组：金匮肾气汤治疗组20只;F组：健脾肾气汤治疗组20只;G组：活血化淤汤治疗组20只。除A组(正常对照组)外，其他组大鼠均做右肾切除手术。

1.2 实验用药品

阿霉素(ADR)：深圳万乐药业有限公司生产，使用时以生理盐水稀释成1 mg/ml的溶液。

金匮肾气汤：由熟地、山萸肉、山药、泽泻、茯苓、丹皮、肉桂、炮附子、黄芪等药组成;煎制成含生药约0.67 g/ml浓度的药汁。

健脾益肾解毒汤：党参、白术、云苓、干草、淫羊霍、肉苁蓉、芡实、公英、双花、板蓝根等药组成;煎制成含生药约0.67 g/ml浓度的药汁。

活血化淤汤：丹参、赤芍、当归、川芎、红花、云苓、泽泻、车前子、防己、白茅根、夏枯草、昆布、海藻、坤草等药组成;煎制成含生药约0.67 g/ml浓度的药汁。

1.3 动物模型制备及药物治疗

第一次ADR注射：右肾摘除术后第8天，C、D、E、F、G组第一次ADR注射，经大鼠尾静脉缓慢推注ADR 5 mg/kg，形成肾病模型。

第二次ADR注射：第一次ADR注射满一个月，第2次尾静脉注射药物前3天，开始灌胃给药，E、F、G组分别予相应的中药灌胃，每日1次，1.5 ml/100 g体重，正常组、右肾切除组、肾病组、肾硬化模型组给生理盐水1.5 ml/100 g体重。连续灌胃3天后D组、E组、F组、G组开始第二次注射ADR，给D、E、F、G组每只大鼠尾静脉注射ADR 3 mg/kg。

给阿霉素前、两次注射阿霉素前后均测定尿蛋白、尿糖、血尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白。

1.4 胶原检测

取部分左肾肾皮质组织，采用免疫组化SABC法检测肾组织Collagen III、Collagen IV，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.5 统计分析

采用SPSS12.0统计软件进行统计学处理。所有资料均采用±s表示;多组资料间比较，采用One Way ANOVA分析，以α=0.05作为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

各组之间III型胶原和IV型胶原表达见表1。由表1 可以看出，Collagen III型胶原在正常对照组、右肾切除对照组有少量表达，主要分布在肾小管上皮细胞、肾间质，统计学分析表明正常对照组和右肾切除组间差异无显著性(P>0.05)。而肾病组、肾硬化组表达显著高于正常对照组和右肾切除组，主要分布在肾小管上皮细胞、肾间质，并且在肾小球出现积聚。金匮肾气汤组、健脾组的肾间质分布较正常对照组、右肾切除对照组有显著升高，但与肾病组、肾硬化组比较则分布比明显减少，肾小球无明显表达(P<0.05),活血化淤组分布较肾病组和肾硬化组减少更为明显(P<0.01)。

Collagen IV免疫组织化学检测发现正常对照组、右肾切除对照组有少量表达，二者之间无显著性差异(P>0.05)，主要分布在肾小球基膜、肾间质。肾病组、肾硬化组大量表达，显著高于正常对照组和右肾切除组(P<0.05)，主要分布在肾小球细胞间质、肾间质、肾小管上皮细胞。金匮肾气汤组、活血化淤组、健脾组表达较肾病组、肾硬化组减轻，统计学分析表明，金匮肾气汤组、活血化淤组、健脾组表达显著低于肾病组和肾硬化组;活血化淤组、健脾组表达较金匮肾气汤组减轻更为显著P<0.01)。表1 各组免疫组织化学检测检测胶原纤维阳性面积比 (±s)

3 讨 论

肾小球ECM是MC存在的外环境。正常状况下，存在于系膜的种种细胞外基质对维持正常的肾小球形态及功能起着重要作用。在病理状态下，无论肾小球损害的原因何在，系膜区沉积的细胞外基质成分量和质均发生明显的变化。一方面，正常ECM成分明显增加;另外，间质胶原不仅出现沉积，而且其过度产生更是肾小球疾病后期进展性肾硬化的主要原因[2]。有研究者通过一侧肾切除加重复阿霉素注射制备了加速型肾小球硬化大鼠模型，应用酶联免疫吸附试验对分离的肾小球内ECM进行了硬化过程动态的定量研究，发现胶原IV、LN和FN为正常肾小球内存在的ECM，在肾小球硬化的早、中期明显增加：弥漫性肾小球硬化期分别为正常肾的12.3、16.3和5.1倍，胶原Ⅲ在正常肾小球内不存在;疾病所致的肾小球硬化过程胶原Ⅲ持续增加，弥漫性肾小球硬化期，较正常肾增加11.8倍[3]。因此ECM的成分的变化如collagen Ⅲ、collagen IV等已成为国内外大量研究药物对肾硬化的治疗效果的指标[4]。

本实验研究发现，正常对照组、右肾切除对照组肾小球中无Collagen Ⅲ表达,而肾病组、肾硬化组表达显著升高。金匮肾气汤组、健脾组、活血化淤组肾小球无明显表达。表明正常的肾小球不表达Collagen Ⅲ，而随肾小球的病变程度加重，肾小球系膜区Collagen Ⅲ的集聚就越多，这与文献相符[5]。在三组中药治疗的大鼠中活血化淤组、健脾组、金匮肾气汤组肾小球不表达Collagen Ⅲ，这说明上述中药治疗可能有防止CollagenⅢ在肾小球中的聚集的作用。

Ⅲ型胶原主要表达在肾小管上皮细胞和肾间质，从正常对照组、右肾切除对照组、肾病组到肾硬化组，随肾脏病变程度加重而Ⅲ型胶原在肾小管上皮细胞和肾间质的表达也逐渐加强。而从金匮肾气汤组、健脾益肾组到活血化淤组则Ⅲ型胶原的表达逐渐减轻、减少。并且肾小管间质Ⅲ型胶原明显多于肾小球。这表明肾小管间质中的纤维化比肾小球严重，肾小管间质的损伤可能对肾小球硬化起重要作用。已证实除微小病变型外，其他所有不同类型肾炎中肾小管间质病变与肾衰竭有高度相关性;肾小管间质病变可直接引起肾小球硬化或纤维化新月体病变[6]。而这三种中药可能能通过减轻肾小管的纤维化从而延缓肾小球的硬化。

近来研究发现,在肾小球硬化的进展过程中，伴有Ⅳ型胶原合成或降解异常,使其在病变肾小球中积聚，从而参与了硬化灶的形成[7]。本研究发现从正常对照组、右肾切除组、肾病组到肾硬化组肾小球中Collagen IV的表达逐渐升高，这与肾小球硬化指数的变化相一致。这说明IV型胶原的表达可能反映了肾小球的硬化程度。而金匮肾气汤组、健脾组、活血化淤组的肾小球中胶原IV的表达明显减轻，以活血化淤组表达最少。这说明上述中药有减轻IV型胶原在肾小球产生、沉积的作用，这与有关文献报道一致[8]。

本研究发现肾病组、肾硬化组细胞外基质成分(Collagen Ⅲ、Collagen IV)增加，而治疗组(金匮肾气汤组、活血化淤组、健脾组)细胞外基质成分减少。减少的程度由金匮肾气汤组、健脾组、活血化淤组逐渐增加，因此，我们可以推测金匮肾气汤、健脾益肾汤、活血化淤汤对肾小球硬化均有一定得治疗效果，能减少肾脏ECM成分的异常集聚，从而具有延缓肾小球硬化进展的作用。而且，以活血化淤组疗效最好，但仍然不能从根本上逆转肾小球硬化。

有研究表明，活血化淤中药是通过降解ECM起作用的[8]。活血化淤药也能通过抑制纤溶酶活性，促进纤溶蛋白溶解，抑制血小板聚集，改善微循环，从而达到抗凝，抑制血栓及改善肾脏缺血性损伤的目的。活血化淤中药如丹参、桃仁、川芎、当归，以及抗纤灵冲剂(丹参、大黄、牛膝、桃仁、当归等)，对减轻肾脏的ECM积聚，防止肾小球硬化，是从多方面起作用的，其不仅能从源头上抑制导致肾小球硬化的各种细胞因子，直接降解积聚的ECM成分，而且有些药物能直接抑制ECM成分的合成。因此，可以发挥祖国医学的优势，用中药来改善肾脏病患者的症状，减轻肾脏的硬化。但活血化淤药物的开发还不完善，还有待于进一步的研究。

本研究表明中药能延缓肾脏的硬化进程，而且以活血化淤中药效果最好，但本实验尚未能对比不同浓度药物治疗的效果，故需要进一步寻求各药的最佳药物浓度，再对比各药效果。但中药到底是通过何种途径干预肾小管间质的进展过程有待进一步研究。

【参考文献】

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[8] 王志钧，陈昭定，林东红,等.中药活血化淤法治疗过敏性紫癜肾炎体会[J].北京中医，1996，(4)∶2728.